王 陳，王 進，賀 笑，揣 新，王紹平，岳正波

（1.合肥工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院，安徽合肥 230009；2.合肥工業(yè)大學，安徽省工業(yè)廢水處理與資源化工程研究中心，安徽合肥 230009；3.安徽馬鋼礦業(yè)資源集團南山礦業(yè)有限公司，安徽馬鞍山 243000）

鉛鋅礦在世界范圍內(nèi)分布非常普遍，目前約有240個鉛鋅礦處于開放狀態(tài)，其中部分礦山已經(jīng)廢棄數(shù)十年〔1〕。廢棄的鉛鋅礦石在微生物作用下源源不斷地產(chǎn)生大量含鉛酸性礦山廢水〔2〕。作為一種有毒的優(yōu)先控制污染物，鉛會對人體腦、腎臟、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)造成嚴重的損傷并引發(fā)一系列血液疾病〔3〕。因此，必須降低鉛在廢水及飲用水體中的含量。一些國家和組織已經(jīng)對于飲用水中鉛含量作了明確規(guī)定，其中世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定飲用水中鉛的最高質(zhì)量濃度為15 mg/L〔4〕。在過去的幾十年里，已經(jīng)開發(fā)出多種去除水體中鉛的技術，如離子交換、電滲析、化學沉淀、電解和膜分離等物理化學方法〔5〕。然而，這些方法大多成本高昂，處理過程中會產(chǎn)生有毒廢物，且處理低濃度的含鉛廢水時通常效率低下〔6〕。因此，有必要開發(fā)出高效低處理成本的含鉛廢水處理技術。

近年來，更為經(jīng)濟有效和環(huán)境友好的生物法逐漸受到研究者們的青睞〔7〕。憑借生長周期短、產(chǎn)生生物量高以及擁有眾多酶系統(tǒng)的優(yōu)勢，絲狀真菌在眾多微生物種類中脫穎而出〔8〕。作為絲狀真菌的一種，曲霉可分泌與重金屬離子結合的有機酸（如草酸和檸檬酸等）〔9〕。然而，真菌細胞的小顆粒尺寸、高分散性以及低細胞密度使得其在工業(yè)應用中難以分離和回收，解決這些問題的較佳方法是將絲狀真菌固定化后投入應用〔10〕。

海藻酸鈉（Sodium alginate，SA）由于無毒、易降解等優(yōu)點，是目前應用最廣泛的固定化載體材料〔11〕。此外，將聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）和沸石加入到固定化載體中可進一步提高機械強度和傳質(zhì)效率〔12〕。由PVA、SA 和沸石制成的復合載體不易團聚，具有良好的吸附性能，已廣泛應用于重金屬廢水處理領域〔13〕。目前關于各種載體材料的研究較為廣泛，但固定化真菌去除金屬離子的機理尚不明確。

基于上述背景，本研究以一株從安徽東部某酸性礦山廢水中分離得到的耐酸曲霉Aspergillussp. MF1 作為受試菌株，采用PVA、SA 和沸石制備復合載體將其固定化并用于去除Pb2+，運用亞細胞分離技術以及五步提取法并通過SEM、FTIR 表征初步揭示固定化曲霉去除Pb2+的機理〔11〕，以期為酸性礦山廢水中鉛的治理提供一定技術參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

采用實驗室從安徽東部某酸性礦山廢水（pH 3.27）中分離得到的耐酸曲霉Aspergillussp. MF1 作為固定化菌株，該菌株保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為GDMCC No. 61350。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良馬丁培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、酵母浸粉2 g、蛋白胨5 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸氫二鉀1 g、超純水（18.25 MΩ·cm）1 000 mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉10 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉 20 g、超純水1 000 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

采用PDA 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)Aspergillussp. MF1 48 h后，向培養(yǎng)基中加入5 mL無菌水，用接種環(huán)輕輕刮取培養(yǎng)基表面，將孢子洗脫于裝有45 mL無菌水的試管中，用無菌濾紙過濾，制得孢子懸浮液，顯微鏡下采用血球計數(shù)板測定孢子量為8×1010CFU/L，4 ℃下冷藏儲存。

1.2.2 固定化Aspergillussp. MF1 的制備

采用PVA、SA、沸石作為載體材料，向其中加入超純水，使得PVA、SA、沸石質(zhì)量分數(shù)分別為6%、2%、4%，隨后加熱至60 ℃使其溶解，于121 ℃、30 min 條件下滅菌，得到凝膠劑。冷卻至室溫后向凝膠劑中加入1.2.1 節(jié)中制備的孢子懸浮液使得菌懸液質(zhì)量分數(shù)為20%（實驗設置空白組，空白組加入等量無菌水），振蕩均勻后無菌條件下用注射器吸取1 mL 上述混合液逐滴滴入盛有質(zhì)量分數(shù)為4%的CaCl2交聯(lián)液的錐形瓶中，即得固定化Aspergillussp. MF1。將待固化的固定化Aspergillussp. MF1 繼續(xù)置于交聯(lián)液中固化交聯(lián)2 h，過濾后再用已滅菌的0.9%NaCl 溶液沖洗若干次，備用。

1.2.3 固定化Aspergillussp. MF1 對Pb2+的去除

用1 mol/L HCl與NaOH 將改良馬丁培養(yǎng)基pH 調(diào)至3.5，滅菌冷卻后加入過濾滅菌后的Pb2+儲備液將培養(yǎng)基初始Pb2+質(zhì)量濃度分別調(diào)整至10、20、50、100、200 mg/L，將1.2.2 節(jié)中制得的固定化Aspergillussp.MF1 接種于上述含Pb2+培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)120 h，培養(yǎng)結束后于4 000 r/min轉速下離心5 min，離心后取樣品上清液采用火焰原子吸收法（原子吸收光譜儀AA240FS，VARIAN，USA）測定Pb2+濃度，每組實驗設置3 個平行。另外測定相同條件下空白載體PVA-SA-沸石和曲霉Aspergillussp. MF1 對Pb2+的去除效果。

1.2.4 Pb2+在固定化Aspergillussp. MF1 內(nèi)的亞細胞分布和化學形態(tài)分布

利用差速離心法和五步提取法分別對Pb2+在固定化Aspergillussp. MF1 內(nèi)的亞細胞分布和化學形態(tài)分布進行相關分析，五步提取法所用到的化學試劑及所提取Pb2+對應的化學形態(tài)見表1。

表1 五步提取法所用試劑及對應Pb2+化學形態(tài)Table 1 Reagents used in five-step extraction and corresponding chemical morphology of Pb2+

1.2.5 固定化Aspergillussp. MF1 的表征

采用Gemini 500 SEM（德國蔡司）掃描電子顯微鏡對去除Pb2+前后固定化Aspergillussp. MF1 的表面進行觀察；采用傅里葉紅外光譜儀（Nicolet IS50 iN10，美國賽默飛）對去除Pb2+前后固定化Aspergillussp. MF1 表面基團進行分析。

1.2.6 固定化Aspergillussp. MF1 的重復利用性

將1.2.2 節(jié)中制得的固定化Aspergillussp. MF1在無菌條件下加入到Pb2+初始質(zhì)量濃度為10 mg/L的改良馬丁培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后采用火焰原子吸收法測定培養(yǎng)基中剩余Pb2+濃度，并將培養(yǎng)基過濾后所得固定化Aspergillussp. MF1 置于0.05 mol/L 的硝酸溶液中洗脫2 h，用濾紙吸干表面水分重新置于Pb2+初始質(zhì)量濃度為10 mg/L 的新鮮改良馬丁培養(yǎng)基中培養(yǎng)。重復上述操作，考察固定化Aspergillussp. MF1 的重復使用情況。

2 結果與討論

2.1 固定化Aspergillus sp. MF1 對Pb2+的去除

空白載體PVA-SA-沸石、曲霉Aspergillussp. MF1、固定化Aspergillussp. MF1對Pb2+的去除效果見圖1。

圖1 空白載體、Aspergillus sp. MF1 及固定化Aspergillus sp. MF1 對Pb2+的去除效果Fig.1 Pb2+ removal effects of blank carrier，Aspergillus sp. MF1 and immobilized Aspergillus sp. MF1

由圖1 可知，隨著初始Pb2+質(zhì)量濃度增加，各物質(zhì)對于Pb2+的去除率均逐漸降低。一方面隨著初始Pb2+質(zhì)量濃度的增加，載體表面活性位點逐漸飽和，從而抑制了載體對Pb2+的吸附；另一方面，Pb2+對于曲霉Aspergillussp. MF1 的生物毒性隨Pb2+濃度的增加而增強，因此，曲霉Aspergillussp. MF1 的生長代謝受到抑制〔14〕。但隨著初始Pb2+濃度的增加，單位質(zhì)量曲霉Aspergillussp. MF1、固定化Aspergillussp. MF1 對Pb2+的去除能力增加，這是由于Pb2+較高的濃度梯度可以成為克服水相和固相之間金屬離子傳質(zhì)阻力的驅動力，導致Pb2+與活性位點之間碰撞的可能性更高〔15〕。同時，不同Pb2+濃度條件下，固定化Aspergillussp. MF1 對Pb2+的去除效果均優(yōu)于其他兩組物質(zhì)，這可以歸因于PVA-SA-Zeolite 載體對曲霉Aspergillussp. MF1 的保護使其更能耐受Pb2+的脅迫。綜上，在初始Pb2+質(zhì)量濃度為10 mg/L 時，固定化Aspergillussp. MF1 具有最佳Pb2+去除效果，Pb2+去除率為78.26%，此時單位質(zhì)量固定化Aspergillussp. MF1 對于Pb2+的去除量為2.45 mg/g。

2.2 Pb2+的亞細胞分布

Pb2+在固定化Aspergillussp. MF1 內(nèi)的亞細胞分布見圖2。

圖2 Pb2+的亞細胞分布Fig.2 Subcellular distribution of Pb2+

由圖2可知，在初始Pb2+質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200 mg/L 時，Pb主要積聚在菌體細胞的細胞壁與可溶性組分中，二者中Pb占總量的92.04%～95.90%。細胞壁是抵抗重金屬元素應激的第一道屏障，它可以限制細胞對重金屬元素的攝取。細胞壁含有蛋白質(zhì)和多糖，包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，它們提供了許多潛在的配體，如羥基、羧基、氨基和硫醇基團，這些配體可以與重金屬陽離子形成絡合物以限制其跨膜運輸〔16〕，因此，Pb2+由于配體螯合作用被細胞壁吸收。然而，細胞壁結合Pb2+的能力有限。因此，當細胞壁結合位點達到飽和時，過量的Pb2+通過菌體細胞壁和細胞膜上存在的離子通道進入細胞，此時，大多數(shù)細胞內(nèi)重金屬離子被運送到液泡中，從而實現(xiàn)重金屬區(qū)室化，以隔絕Pb對細胞器的毒害〔17〕。研究表明液泡占細胞體積的90%，富含有機酸、蛋白質(zhì)和生物堿，能將重金屬離子螯合，將其轉化為毒性較小的復合物，因此，液泡被認為是重金屬元素積累和解毒的第二道屏障，也構成了最終的屏障位點，從而決定了細胞在重金屬元素存在下存活的能力〔18〕。此外，金屬硫蛋白（MTs）和一些活性物質(zhì)的螯合作用都可以限制有毒金屬元素在生物體內(nèi)的運動〔17〕。

2.3 Pb2+的化學形態(tài)分布

金屬的遷移和毒性程度取決于其化學形態(tài)，例如無機態(tài)或水溶態(tài)的金屬通常比難溶態(tài)、果膠態(tài)和草酸鹽態(tài)的金屬具有更高的遷移性和毒性〔19〕。本研究中Pb2+在固定化Aspergillussp. MF1內(nèi)的化學形態(tài)分布見圖3。

圖3 Pb2+的化學形態(tài)分布Fig.3 Chemical morphological distribution of Pb2+

由圖3可知，在不同Pb2+質(zhì)量濃度下培養(yǎng)固定化菌種5 d 后，Pb 主要以果膠態(tài)（35.21%～42.93%）和難溶態(tài)形式（30.34%～36.45%）存在，草酸鹽態(tài)Pb 占5.53%～16.00%，僅3.86%～12.39%的Pb 以無機態(tài)和水溶態(tài)形式存在。不溶性磷酸鉛復合物和草酸鹽態(tài)Pb 可以固定細胞內(nèi)游離的Pb2+從而降低其對于細胞的毒性〔20〕。這些低毒形式的Pb 容易在細胞壁等部位沉淀〔21〕，故這種方式是曲霉應對Pb2+脅迫的關鍵所在，即將無機態(tài)的Pb 轉化為有機態(tài)的低毒形式的Pb，從而幫助自身更好地應對逆境。

2.4 固定化Aspergillus sp. MF1 的表征

2.4.1 環(huán)境掃描電鏡及能譜分析

去除Pb2+前后固定化Aspergillussp. MF1 的SE M和EDS 分析結果如圖4 所示。

圖4 固定化Aspergillus sp. MF1 的SEM 和EDS 分析Fig.4 SEM and EDS analysis of immobilized Aspergillus sp.MF1

在圖4（a）中，固定化Aspergillussp. MF1 表面呈現(xiàn)出疏松多孔結構，具有較高的比表面積。這些特性可以降低擴散阻力，加強傳質(zhì)，促進菌體生長〔22〕。此外，圖4（a）中菌絲完整性好，排列規(guī)整，而圖4（b）顯示固定化Aspergillussp. MF1 表面菌絲結構發(fā)生了變化，菌絲排列雜亂且不完整，表明Pb2+對菌絲有一定的脅迫作用。對比Pb2+去除前后元素分析結果，Pb 元素的出現(xiàn)表明固定化Aspergillussp. MF1 對Pb2+有一定的去除作用。因此，固定化Aspergillussp. MF1 的高比表面積在Pb2+的去除過程中至關重要。

2.4.2 傅里葉紅外光譜分析

去除Pb2+前后固定化Aspergillussp. MF1 的紅外光譜見圖5。

圖5 去除Pb2+前后固定化Aspergillus sp. MF1 的FTIRFig.5 FTIR of immobilized Aspergillus sp.MF1 before and after removal of Pb2+

圖5 中，在去除Pb2+前的固定化Aspergillussp. MF1譜圖中，3 369 cm-1處吸收峰主要由—OH（來源于載體材料PVA 等）和—NH2（菌體細胞分泌的芳香胺類物質(zhì)等）伸縮振動引起〔23〕；2 928 cm-1處的吸收峰來源于SA中六元環(huán)結構的—CH2的反對稱伸縮振動〔3〕；1 655 cm-1處的吸收峰則來自于菌體細胞分泌的小分子羧酸中的—C=O 伸縮振動；1 548 cm-1處的吸收峰源于仲酰胺類物質(zhì)酰胺Ⅱ帶N—H 的振動，也可能是羧酸鹽中—COOH 的非對稱伸縮振動的結果〔24〕；1 422 cm-1處吸收峰與芳香族的—N=O 發(fā)生伸縮振動有關〔23〕；1 238 cm-1處與1 038 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰分別是芳香酸酯C—O—C 對稱伸縮振動和糖類C—O 伸縮振動的結果〔25〕；803 cm-1處的吸收峰源于芳香碳上—C—H 的平面振動，也有可能由CO32-外部彎曲振動產(chǎn)生〔8，26〕。在固定化Aspergillussp. MF1 去除Pb2+后，原3 369 cm-1處吸收峰偏移至3 399 cm-1處，原1 655 cm-1處吸收峰偏移至1 652 cm-1處，原1 548 cm-1處吸收峰強度減弱，原1 422 cm-1處吸收峰強度顯著增強，原1 038 cm-1處吸收峰偏移至1 030 cm-1處，原803 cm-1處吸收峰偏移至801 cm-1處，這表明固定化Aspergillussp. MF1 中載體表面的活性基團以及來自菌體分泌的小分子羧酸、芳香類物質(zhì)參與到了對Pb2+的去除過程中。

2.5 固定化Aspergillus sp. MF1 的重復利用性

固定化Aspergillussp. MF1 的重復利用性實驗結果見圖6。

圖6 固定化Aspergillus sp. MF1 的重復利用性Fig.6 Reusability of immobilized Aspergillus sp.MF1

由圖6可知，在pH=3.5，初始Pb2+質(zhì)量濃度為10 mg/L條件下，固定化Aspergillussp. MF1通過使用稀硝酸進行解吸處理，可循環(huán)使用5次且對Pb2+的去除率均能達到30%以上。使用稀硝酸進行解吸可有效地從固定化Aspergillussp. MF1中回收吸附的Pb2+，這是因為酸性溶液中豐富的H+能夠從固定化Aspergillussp. MF1中置換結合的Pb2+，從而解吸它們并釋放官能團用于再次結合〔27〕。以上結果表明，固定化Aspergillussp. MF1可重復使用，并可回收其吸附的Pb2+，因此這種生物吸附劑在工業(yè)應用中更具吸引力〔28〕。除此之外，本研究中制得的固定化Aspergillussp. MF1在循環(huán)使用期間未發(fā)生破裂、內(nèi)部有機成分泄露情況，對于被修復水體不會帶來環(huán)境影響。

3 結論

本研究成功地將從酸性礦山廢水中分離的曲霉Aspergillussp. MF1用于固定化微球的制備。在pH=3.5，初始Pb2+質(zhì)量濃度為10 mg/L時該固定化微球對Pb2+的去除率最高可達78.26%，單位質(zhì)量去除量為2.45 mg/g。固定化Aspergillussp. MF去除Pb2+的機理可初步總結為兩點，一是固定化Aspergillussp. MF1的高比表面積、PVA和SA 等材料表面活性基團利于對Pb2+的吸附，二是Aspergillussp. MF1細胞壁對于Pb2+具有螯合、吸附和離子交換作用，而液泡和其他細胞器的隔室化作用也能將Pb2+區(qū)室化，使得細胞器免受Pb2+的毒害。此外，固定化Aspergillussp. MF1 連續(xù)使用5 個循環(huán)后對Pb2+去除率仍能達到30%以上，且在去除過程中未發(fā)生破裂、細胞泄露等情況。因此，可以認為固定化Aspergillussp.MF1在含Pb2+酸性廢水的處理中具有一定的應用潛力。