李雨君，曾春暉，李森華，言嬌霞，楊 柯

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西高校中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001）

腎結(jié)石是泌尿外科的常見疾病，腎小管損傷、草酸鈣濃度過飽和晶體粘附是腎結(jié)石發(fā)生的必要條件，腎小管上皮細(xì)胞與草酸鈣晶體之間的相互作用可導(dǎo)致細(xì)胞損傷［1］，受損的腎小管上皮細(xì)胞為草酸鈣晶體的粘附與沉積提供附著點(diǎn)，從而促進(jìn)結(jié)石的形成。盡管目前腎結(jié)石形成機(jī)制尚未完全清楚，但近年來研究表明自噬與腎結(jié)石的形成密切相關(guān)［2-3］。自噬是真核細(xì)胞本身具有的一種保護(hù)和防御機(jī)制，它可有效降解細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)對腎小管上皮細(xì)胞的損害，維持真核細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

課題組前期研究表明五眼果體外可抑制一水合草酸鈣晶體（COM） 形成［4］，其水提物體內(nèi)可通過降低小鼠IL-6和TNF-α 水平，減輕小鼠炎癥免疫反應(yīng)引起的腎臟損傷，抑制小鼠泌尿系統(tǒng)草酸鈣結(jié)石的發(fā)生［5］。在炎癥發(fā)生的過程中常伴隨自噬的產(chǎn)生，過度的自噬會(huì)加重腎小管上皮細(xì)胞的損傷，促進(jìn)結(jié)石的形成。因此，本實(shí)驗(yàn)基于P38 MAPK/ERK 自噬通路探討五眼果水提物對COM 晶體損傷腎上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人腎小管上皮細(xì)胞HKC，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。

1.2 藥物與試劑 五眼果購自桂林鼎康中藥飲片有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)郭敏副教授鑒定為漆樹科植物南酸棗Choerospondiasaxillaris（Roxb.） Burtt et Hill 的干燥果實(shí)。BCA 蛋白質(zhì)試劑盒（批號(hào)16E25C46，武漢博士德生物工程有限公司）； LDH、Ca2＋檢測試劑盒 （批號(hào)20210311、20210720，南京建成生物工程研究所）； LC3B、P62、pmTOR、Beclin-1 抗體 （ 批號(hào) 2755S、39749S、5536S、3738S，美國Cell Signaling Technology 公司）； mTOR、P38、ERK1/2、p-ERK1/2 抗體 （批號(hào) 10018370、10018370、00057920、00097416，美國Proteintech 公司）； p-P38 抗體（批號(hào)7gd6101，江蘇親科生物研究中心有限公司）。

1.3 儀器 TCSPS5II 激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）； Synergy H1 酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）； TS2 倒置顯微鏡成像系統(tǒng)（日本Nikon 公司）； DYY-6D 六一電泳儀（北京六一生物科技有限公司）； C170 二氧化碳培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司）。

2 方法

2.1 五眼果水提物制備 取2 kg 藥材粗粉，加入12 L 蒸餾水，浸泡30 min，加熱提取2 h，過濾取濾液； 藥渣加10 L蒸餾水加熱提取1 h，過濾取濾液，合并2 次濾液，并濃縮得0.4 kg 浸膏，即得五眼果水提物。用含10%血清的培養(yǎng)基將五眼果水提物配制成1 mg/mL 母液，0.22 μm 濾膜過濾除菌備用，用時(shí)配制成所需質(zhì)量濃度。

2.2 COM 晶體制備 參考文獻(xiàn)［6-7］ 報(bào)道方法稍加改進(jìn)，10 mol/L 草酸鈉溶液和10 mol/L 氯化鈣溶液混勻，置于4 ℃冰箱靜置3 d，4 ℃、1 000 r/min 離心15 min，用超純水反復(fù)清洗沉淀物3 次，將沉淀物置于50 ℃烘箱干燥，研磨成粉末，滅菌、密封備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)用含10%血清的培養(yǎng)基配制成100 μg/mL COM 晶體。

2.3 細(xì)胞分組及處理 取對數(shù)生長期HKC 細(xì)胞，接種于孔板，待貼壁后將細(xì)胞分為正常組、模型組和五眼果水提物高、中、低劑量組（160、80、40 μg/mL），除正常組外其余各組用100 μg/mL COM 晶體損傷細(xì)胞，藥物組同時(shí)給予相應(yīng)質(zhì)量濃度藥物，培養(yǎng)24 h。

2.4 細(xì)胞LDH 活性和細(xì)胞活性檢測 取對數(shù)生長期HKC細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)的密度接種于96 孔板，按“2.3”項(xiàng)下方法處理24 h 后取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定LDH 活性。然后向各孔加入100 μL MTT （0.5 mg/mL）溶液，避光孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，在570 nm 波長處測定吸光度值。

2.5 細(xì)胞粘附情況及Ca2＋水平檢測 取對數(shù)生長期HKC細(xì)胞，以每孔7×104個(gè)的密度接種于6 孔板，按“2.3” 項(xiàng)下方法處理24 h 后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和粘附晶體數(shù)量。然后用PBS 清洗細(xì)胞3 次，加入30 μL 5 mol/L鹽酸，晃動(dòng)6 孔板使鹽酸浸潤細(xì)胞，收集樣品至離心管靜置1 h，14 000 r/min 離心10 min，取上清液按照鈣離子試劑盒說明書進(jìn)行測定。

2.6 細(xì)胞自噬流檢測 取對數(shù)生長期HKC 細(xì)胞，以每皿1×104個(gè)的密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿，待貼壁后，吸棄上清液，加入含有腺病毒MOI 值為100 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后更換回完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸棄上清液，按“2.3” 項(xiàng)下方法處理24 h 后，于激光顯微共聚焦下觀察各組細(xì)胞自噬流，紅綠熒光通過Merge 后出現(xiàn)的紅色斑點(diǎn)為自噬溶酶體，黃色斑點(diǎn)為自噬體，通過不同顏色斑點(diǎn)的計(jì)數(shù)可判斷自噬流的強(qiáng)弱。

2.7 自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 取對數(shù)生長期HKC 細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)的密度接種于6 孔板，按“2.3” 項(xiàng)下方法處理24 h 后，收集細(xì)胞，提取蛋白，BCA 蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。各組蛋白樣本通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到甲醇活化的PVDF 膜上，于無蛋白的快速封閉液中室溫封閉30 min，置于一抗溶液中4 ℃孵育過夜，TBST 清洗膜后，將膜置于二抗溶液中室溫孵育2 h，TBST 清洗膜后，與ECL 底物試劑盒反應(yīng)后，于凝膠成像儀中發(fā)光顯色。使用Image Lab 6.0 軟件測量目標(biāo)蛋白灰度值，分析各組目的蛋白的表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 五眼果水提物對COM 晶體損傷HKC 細(xì)胞損傷的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞存活率降低（P＜0.01），細(xì)胞上清液中LDH 活性升高（P＜0.01）； 與模型組比較，五眼果水提物高、中劑量組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05），細(xì)胞上清液中LDH 活性降低（P＜0.01），見圖1。

3.2 五眼果水提物對COM 晶體損傷HKC 細(xì)胞黏附性的影響 與正常組比較，模型組大量晶體粘附在細(xì)胞表面，細(xì)胞間隙變大，有內(nèi)容物流出，Ca2＋水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，五眼果水提物各劑量組上述變化明顯減輕，Ca2＋水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖2～3。

圖2 五眼果水提物對COM 晶體損傷細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）

圖3 五眼果水提物對COM 晶體損傷HKC 細(xì)胞Ca2＋水平的影響（±s，n＝3）

3.3 五眼果水提物對COM 晶體損傷HKC 細(xì)胞自噬流的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體數(shù)量增加（P＜0.01）； 與模型組比較，五眼果水提物各劑量組細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體數(shù)量減少（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

圖4 五眼果水提物對COM 晶體損傷HKC 細(xì)胞自噬流的影響（±s，n＝3）

3.4 五眼果水提物COM 晶體損傷HKC 細(xì)胞自噬相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞p-ERK1/2/ERK1/2 和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高（P＜0.05），P62 蛋白表達(dá)和p-mTOR/mTOR 比值有降低趨勢，Beclin-1 蛋白表達(dá)和p-P38/P38 比值有升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 與模型組比較，五眼果水提物高劑量組細(xì)胞p-ERK1/2/ERK1/2、LC3BⅡ/LC3BⅠ比值降低（P＜0.05，P＜0.01），而低劑量組細(xì)胞Beclin-1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖5～7。

圖5 五眼果水提物對受損細(xì)胞自噬相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

圖6 各組細(xì)胞Beclin-1、LC3B、P62、P38 MAPK 蛋白表達(dá)

圖7 各組細(xì)胞ERK1/2、mTOR 蛋白表達(dá)

4 討論

HKC 細(xì)胞具有存活時(shí)間長、易于傳代培養(yǎng)的特點(diǎn)，并且具有腎小管上皮細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)和功能［8］，COM 晶體易與細(xì)胞表面粘附，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷，受損灶為晶體提供有效的附著點(diǎn)，不斷循環(huán)加重晶體對細(xì)胞的損傷，促進(jìn)草酸鈣腎結(jié)石的形成［1］，因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建體外COM晶體損傷HKC 細(xì)胞模型進(jìn)行研究。在正常狀態(tài)下，各種組織細(xì)胞中LDH 釋放量較少，LDH 釋放量升高可反映細(xì)胞損傷的情況［9-10］，COM 晶體粘附在細(xì)胞表面，可通過測定Ca2＋水平評價(jià)腎小管上皮細(xì)胞損傷后晶體在細(xì)胞表面的黏附性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五眼果水提物可升高細(xì)胞存活率，降低COM 晶體與細(xì)胞的黏附性，減少LDH 釋放，對COM晶體損傷的HKC 細(xì)胞具有保護(hù)作用。

正常腎臟有較高的代謝需求，損傷會(huì)加重代謝紊亂，并激活許多類型腎細(xì)胞的自噬，它是腎小管的一種損傷反應(yīng)［11］。在自噬相關(guān)研究中，mRFP-GFP-LC3 腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞在自噬流的檢測中應(yīng)用廣泛。GFP 在溶酶體酸性環(huán)境中可使其綠色熒光發(fā)生猝滅，綠色熒光減弱指示自噬小體與溶酶體融合成自噬溶酶體。而mRFP 對酸性環(huán)境不敏感，在溶酶體酸性環(huán)境中不會(huì)使其紅色熒光減弱。共聚焦顯微鏡成像后合成紅綠色熒光，圖片中黃色斑點(diǎn)為自噬體，紅色斑點(diǎn)為自噬溶酶體，紅色斑點(diǎn)越多標(biāo)志著自噬水平增加［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明五眼果水提物可抑制自噬。

腎傷損后導(dǎo)致自噬相關(guān)的多種細(xì)胞信號(hào)通路激活，如AMPK、P38 MAPK、ERK 和JNK 通路［13］。P38 MAPK 通路是MAPK 信號(hào)通路里的一個(gè)重要亞型，在調(diào)控細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要的作用，其作用機(jī)制主要通過抑制mTOR 依賴性途徑，激活自噬［14］。ERK 也是MAPK 家族重要的亞型之一，包括ERK1 和ERK2。Raf/MEK/REK 信號(hào)通路在應(yīng)激的情況下激活ERK，ERK 信號(hào)通路被激活后不僅可激活自噬，還可以通過上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3B 和P62 來誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［15-16］。近年來研究表明P38 MAPK 和ERK 信號(hào)通路與腎結(jié)石的形成有關(guān)，草酸刺激細(xì)胞可激活P38 MAPK 和ERK 信號(hào)通路，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬以迅速響應(yīng)各種應(yīng)激，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，若過度自噬則會(huì)加劇損傷，促進(jìn)結(jié)石的形成［17-19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五眼果水提物可降低P38 MAPK、ERK1/2 磷酸化和LC3BⅡ/LC3BⅠ表達(dá)。

綜上所述，五眼果水提物可通過調(diào)控P38 MAPK/ERK通路抑制自噬，降低晶體與細(xì)胞的粘附性，從而減輕草酸鈣晶體對腎小管上皮細(xì)胞的損傷。