李 莉，劉 茹，何 晶，陳 云，郭 娟，紀(jì) 可，劉 玲

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065）

睡眠障礙是常見的身體功能障礙，表現(xiàn)為睡眠-覺醒過程中的各種功能紊亂，其中失眠較為常見［1］。睡眠障礙可導(dǎo)致認(rèn)知能力下降和神經(jīng)精神障礙，影響長期記憶形成并伴隨焦慮樣行為的產(chǎn)生［2］。我國有45.5% 人群存在睡眠問題，其中老年人占比高達(dá)56.7%［3］。因此，改善睡眠障礙對我國居民健康尤其是中老年人來說顯得尤為重要。

目前臨床治療睡眠障礙的藥物多為唑吡坦、艾司佐匹克隆、扎來普隆、褪黑激素等，部分藥物會導(dǎo)致嗜睡等不良反應(yīng)，而中醫(yī)藥具有毒副作用小的特點(diǎn)［4-6］。溫膽湯由6 味中藥組成［7］，研究發(fā)現(xiàn)黃連和酸棗仁加味的溫膽湯對失眠有較好的療效［8］；溫膽湯配合認(rèn)知-行為療法對慢性失眠痰熱內(nèi)擾癥療效較好［9］； 溫膽湯含藥血清可抑制谷氨酸環(huán)境下星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡［10］。睡眠障礙將直接導(dǎo)致大腦神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)元損傷，由此推測溫膽湯能夠修復(fù)睡眠障礙導(dǎo)致的神經(jīng)損傷。本研究通過構(gòu)建失眠小鼠模型，給予溫膽湯干預(yù)，觀察小鼠大腦皮層、海馬組織CA1 區(qū)、下丘腦的病理變化，檢測血清和腦組織中細(xì)胞因子的變化，并基于IκB 激酶β （IκB kinase-β，IKKβ） /核轉(zhuǎn)錄因子-κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 通路探討可能的作用機(jī)制，以期為溫膽湯緩解睡眠障礙提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑 伊紅、中性樹脂、蘇木素、DAB 濃縮型試劑盒、封閉山羊血清（貨號E8090、G8590、G1140、DA1010、SL038，北京索萊寶科技有限公司）； 免疫組化試劑盒（貨號KIT-5020，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）； 尼氏染色液（貨號G1036，武漢賽維爾生物科技有限公司）； 白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β （interleukin 1β，IL-1β）、神經(jīng)絲輕鏈 （neurofilament light chain，NEFL）、神經(jīng)特異性烯醇化酶 （neuron specific enolase，NSE） 試劑盒、兔抗小鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、GAPDH抗體、山羊抗兔二抗（貨號MU30044、MU30030、MU30369、MU30977、MU30617、PAB32097、PAB36269、SAB43714，武漢貝茵萊生物科技有限公司）； S100 鈣結(jié)合蛋白B （S100 calcium binding protein B，S100B） 試劑盒（貨號JYM0833M，武漢基因美生物科技有限公司）； 戊巴比妥鈉（貨號P3761，美國Sigma 公司）； 兔抗小鼠IKKβ、NFκB、p-IKKβ、p-NF-κB 抗體 （ 貨號 ab178872、ab220803、ab38515、ab288751，英 國 Abcam公司）。

1.2 藥物 溫膽湯所用中藥飲片購自湖北省中醫(yī)院門診中藥房，并經(jīng)劉玲教授鑒定為正品； 艾司唑侖片（規(guī)格1 mg/片，批號H42021522，華中藥業(yè)股份有限公司），將1 片艾司唑侖片溶于167 mL水，配制成6 μg/mL 的溶液。

1.3 儀器 DM1000 型顯微鏡、RM2235 型切片機(jī)（德國徠卡公司）； DHG-9023A 型恒溫烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）； TKD-TK 型攤片烤片機(jī)、TKD-TSF 型自動(dòng)組織脫水機(jī)（湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司）； TB-718L 型包埋機(jī)、TB-718D 型生物組織包埋機(jī)（湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司）；352 型酶標(biāo)儀 （芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司）； AC-8 型洗板機(jī)（美國Thermo Labsystems 公司）； JM-A3002 型電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）； 旋轉(zhuǎn)型睡眠剝奪儀（自制）。

1.4 動(dòng)物 30 只雌性昆明小鼠，SPF 級，4 ～5 周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK （鄂） 2018-0012］。小鼠飼養(yǎng)條件為溫度20 ～26 ℃，相對濕度40% ～70%，自由飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司動(dòng)物倫理委員會審查通過（倫理號HLK-20190301-001）。

2 方法

2.1 溫膽湯制備 溫膽湯由半夏6 g、竹茹6 g、麩炒枳實(shí)6 g、陳皮9 g、炙甘草3 g、茯苓4.5 g 組成，每劑含生藥34.5 g。第1 次煎煮加8 倍量水，煮沸后煎40 min，過濾取汁，第2 次煎煮加6 倍量水，煮沸后煎30 min，過濾取汁，合并2 次濾液，濃縮，配制成生藥量0.5、2 g/mL 的溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 睡眠障礙小鼠模型構(gòu)建 通過改良版水平轉(zhuǎn)盤睡眠剝奪法構(gòu)建失眠小鼠模型［11］。使用亞克力塑料板制作睡眠剝奪箱（110 cm×60 cm×40 cm），其底部固定有15 個(gè)圓柱形平臺（直徑6.5 cm，高8 cm），保持10 cm 縱向間距，13 cm 橫向間距，注入23～25 ℃水至平臺下1 cm 處，保持水溫。適應(yīng)性培養(yǎng)7 d 后，將小鼠放置于睡眠箱平臺上進(jìn)行站立訓(xùn)練，當(dāng)其即將進(jìn)入睡眠時(shí)，由于肌肉松弛垂頭觸水或落入水中而驚醒，使其被迫保持清醒站立，早晚各休息1 次，每次30 min，共訓(xùn)練14 d。造模期間，每2 d 記錄1 次小鼠行為學(xué)改變（精神狀態(tài)、飲食）、毛發(fā)和體質(zhì)量，給藥后每天記錄1次小鼠行為學(xué)改變。

2.3 分組及給藥 24 只小鼠按“2.2” 項(xiàng)下方法構(gòu)建睡眠剝奪模型，造模成功后隨機(jī)分為模型組、艾司唑侖片組和溫膽湯低、高劑量組，每組6 只，另選6 只正常飼養(yǎng)的小鼠為對照組。艾司唑侖片組灌胃0.15 mg/kg 艾司唑侖片藥液，溫膽湯低、高劑量組灌胃12.5、50 g/kg 溫膽湯藥液，對照組小鼠灌胃生理鹽水，每天1 次，共7 d，灌胃體積0.5 mL。

2.4 取材 最后1 次給藥12 h 后，眼眶采血0.5～1 mL，離心后收集血清。100 mg/kg 戊巴比妥鈉過量麻醉處死小鼠，收集小鼠腦組織，一半于4%甲醛中固定，另一半于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

2.5 ELISA 法檢測血清及腦組織NEFL、NSE、S100B、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 按照ELISA 試劑盒說明書，分別檢測小鼠血清和腦組織NEFL、NSE、S100B、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

2.6 HE 染色觀察大腦皮層、海馬組織CA1 區(qū)、下丘腦病理變化 取固定好的小鼠腦組織，切取適宜大小，浸蠟包埋，制備病理切片，切片脫蠟，經(jīng)蘇木精染色3 ～6 min，促藍(lán)液返藍(lán)5 ～10 s，0.5%伊紅染色2～3 min，脫水固封后，于顯微鏡下拍照并采集圖像。

2.7 免疫組化染色觀察小鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷情況 取小鼠腦組織切片，二甲苯脫蠟后水化，檸檬酸鈉高壓修復(fù)，30% H2O2孵育消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，血清封閉，加GFAP 一抗孵育過夜，滴加二抗孵育，DAB 染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，1%鹽酸乙醇分化，脫水，封片，于顯微鏡下觀察GFAP 陽性表達(dá)并拍照，使用Image J 軟件分析平均光密度。

2.8 尼氏染色觀察小鼠腦組織神經(jīng)元損傷情況 取小鼠腦組織切片，脫蠟，尼氏染液染色2 ～5 min，0.1%冰醋酸稍分化，脫水，透明，樹膠封固，于顯微鏡下觀察小鼠腦組織神經(jīng)元損傷情況。

2.9 Western blot 法檢測腦組織GFAP、p-IKKβ、p-NF-κB 蛋白表達(dá) 取適量腦組織，剪碎后加入RIPA 裂解液，裂解充分后提取總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，洗膜后加入一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，ECL 顯影，曝光。使用Image J 軟件分析條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 溫膽湯對睡眠障礙小鼠一般情況的影響 如圖1A 所示，實(shí)驗(yàn)開始第7 ～15 天，隨著小鼠睡眠障礙時(shí)間的增加，其體質(zhì)量逐漸降低； 在溫膽湯給藥后第2 天（實(shí)驗(yàn)開始第17 天），溫膽湯各劑量組小鼠體質(zhì)量均高于模型組（P＜0.05）。給藥7 d后，與模型組比較，溫膽湯高劑量組小鼠體質(zhì)量增加（P＜0.01），見圖1B。通過觀察21 d 各組小鼠精神狀態(tài)、飲食和毛發(fā)，發(fā)現(xiàn)睡眠障礙小鼠在給藥前精神狀態(tài)較差、毛發(fā)光澤較差、飲食減少； 給藥后，溫膽湯低、高劑量組小鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)和飲食情況都有所改善，結(jié)果表明溫膽湯能夠改善睡眠障礙導(dǎo)致的小鼠狀態(tài)異常。

圖1 溫膽湯對睡眠障礙小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n＝6）Fig.1 Effects of Wendan Decoction on body weight of sleep disorders mice （±s，n＝6）

3.2 溫膽湯對睡眠障礙小鼠炎癥反應(yīng)的影響 如圖2 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清和腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均升高 （P＜0.01）；與模型組比較，溫膽湯各劑量組血清和腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均降低（P＜0.01），表明溫膽湯具有抑制睡眠障礙小鼠炎癥反應(yīng)的作用。

圖2 溫膽湯對睡眠障礙小鼠血清和腦組織炎癥因子水平的影響（±s，n＝6）Fig.2 Effects of Wendan Decoction on serum and brain inflammatory factors in sleep disorders mice （±s，n＝6）

3.3 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦損傷標(biāo)志物水平的影響 如圖3 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清和腦組織NEFL、NSE、S100B 水平均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，溫膽湯各劑量組小鼠血清和腦組織NEFL、NSE、S100B 水平均降低（P＜0.01），表明溫膽湯能夠緩解睡眠障礙小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

圖3 溫膽湯對睡眠障礙小鼠血清和腦組織腦損傷標(biāo)志物水平的影響（±s，n＝6）Fig.3 Effects of Wendan Decoction on serum and brain brain injury markers in sleep disorders mice （±s，n＝6）

3.4 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織病理變化的影響 如圖4 所示，與對照組比較，模型組小鼠大腦皮層組織中神經(jīng)元細(xì)胞核皺縮變形，細(xì)胞排列雜亂，核染色加深，核仁消失； 海馬CA1 區(qū)組織中神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少，CA1 區(qū)細(xì)胞排列不緊密，水腫明顯； 下丘腦組織神經(jīng)細(xì)胞固縮變形，組織基質(zhì)疏松、呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與模型組比較，隨著溫膽湯劑量的增加，變形的神經(jīng)細(xì)胞逐漸減少，深染固縮的細(xì)胞核形態(tài)變少，排列紊亂現(xiàn)象減少； 神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)逐漸清晰； 下丘腦組織基質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減少。溫膽湯高劑量組腦組織病理改善效果接近于艾司唑侖片組。以上結(jié)果表明，溫膽湯對于睡眠障礙小鼠腦組織病理改善具有良好的效果。

圖4 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織病理變化的影響（×200）Fig.4 Effects of Wendan Decoction on cerebral pathological changes of sleep disorders mice （×200）

3.5 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織GFAP 表達(dá)的影響 如圖5 所示，與對照組比較，模型組小鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 表達(dá)增多（P＜0.01）；與模型組比較，溫膽湯各劑量組GFAP 表達(dá)降低（P＜0.01），表明溫膽湯具有抑制睡眠障礙小鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 活化的作用。

圖5 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織GFAP 表達(dá)的影響（±s，n＝6）Fig.5 Effects of Wendan Decoction on cerebral GFAP expression in sleep disorders mice （±s，n＝6）

3.6 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織神經(jīng)元的影響 如圖6 所示，與對照組比較，模型組小鼠腦組織尼氏小體數(shù)減少； 與模型組比較，溫膽湯各劑量組小鼠腦組織尼氏小體數(shù)增多。此外，與對照組比較，模型組小鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞排列出現(xiàn)混亂，細(xì)胞輪廓不清晰； 與模型組比較，溫膽湯高劑量組小鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞排列整齊，輪廓不清晰的細(xì)胞數(shù)減少。以上結(jié)果表明，溫膽湯具有保護(hù)腦組織神經(jīng)元受損的作用。

圖6 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織神經(jīng)元的影響（×200）Fig.6 Effects of Wendan Decoction on brain neurons in sleep disorders mice （×200）

3.7 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織IKKβ/NF-κB通路活化的影響 如圖7 所示，與對照組比較，模型組小鼠腦組織IKKβ 和NF-κB 蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，溫膽湯各劑量組小鼠腦組織IKKβ 和NF-κB 蛋白磷酸化水平均降低（P＜0.01），表明溫膽湯能夠抑制睡眠障礙小鼠腦組織中IKKβ/NF-κB 通路的活化。

圖7 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織IKKβ/NF-κB 通路活化的影響（±s，n＝6）Fig.7 Effects of Wendan Decoction on activation of cerebral IKKβ/NF-κB pathway in sleep disorders mice （±s，n＝6）

4 討論

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)溫膽湯給藥后睡眠障礙小鼠大腦皮層、海馬組織CA1 區(qū)、下丘腦組織病變均有所改善，提示溫膽湯具有改善神經(jīng)損傷的作用。此外，溫膽湯給藥后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 活化受到抑制。研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 活化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［12］。在頭針聯(lián)合中藥對缺血性腦卒中失眠大鼠的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，睡眠改善后GFAP 也隨之減少［13］。本研究結(jié)果顯示，睡眠障礙小鼠經(jīng)溫膽湯給藥后尼氏小體數(shù)量增多，GFAP 表達(dá)受到抑制，提示溫膽湯能夠保護(hù)睡眠障礙小鼠的神經(jīng)元。

研究表明，慢性失眠患者血清NfH、NfL、NSE、S100B 水平升高，這些指標(biāo)提示存在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)末梢等腦微結(jié)構(gòu)損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，在睡眠障礙小鼠血清和腦組織中腦組織損傷標(biāo)志物NEFL、NSE、S100B 水平均升高，此外本研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子的水平也升高，結(jié)合兩者的變化可以認(rèn)為睡眠障礙導(dǎo)致了腦組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)又引起了腦組織損傷。經(jīng)溫膽湯給藥后，NEFL、NSE、S100B 和炎癥因子水平均降低，提示溫膽湯可通過降低睡眠障礙導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)以及腦組織損傷和神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的標(biāo)志物的過度表達(dá)來調(diào)緩解腦損傷。

炎癥反應(yīng)受到多種通路的調(diào)節(jié)，其中NF-κB通路的研究最為深入［15-16］。IκB 的降解介導(dǎo)NF-κB信號通路的激活，IκB 激酶（IKK） 復(fù)合物可促進(jìn)IκB 的磷酸化［17］。NF-κB 一旦被激活，大量炎性因子的釋放會加重神經(jīng)損傷［18］。研究表明，IKKβ/NF-κB 信號通路的激活與神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［19-20］。Douglass 等［21］發(fā)現(xiàn)，抑制IKKβ/NF-κB信號通路的激活能夠保護(hù)小鼠免受下丘腦炎癥損傷。Fei 等［22］發(fā)現(xiàn)，阻斷IKKβ/NF-κB 信號通路能夠抑制神經(jīng)元的凋亡和炎癥反應(yīng)，從而改善脊髓損傷。本研究結(jié)果顯示，睡眠障礙小鼠腦組織中IKKβ/NF-κB 通路被激活，而經(jīng)溫膽湯給藥后，IKKβ/-NF-κB 通路受到抑制，提示溫膽湯可能通過抑制IKKβ/NF-κB 通路來抑制炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)溫膽湯可改善睡眠障礙小鼠腦組織病變，并可能通過抑制IKKβ/NF-κB 通路的激活減少腦組織中炎癥的發(fā)生，最終發(fā)揮修復(fù)睡眠障礙小鼠神經(jīng)損傷的作用。