彭紫薇，黃嘉怡，李花花，宋 揚，杜守穎，白 潔

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

滑膜炎制劑組方包括夏枯草、女貞子、枸骨葉等13 味中藥，具有清熱利濕、活血通絡(luò)功效［1］，廣泛應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)滑膜炎的臨床治療［2-4］，效果明顯，副作用少［5-6］，但其含量測定指標(biāo)僅為“本品每袋/粒/片含丹參以丹酚酸B 計，不得少于2.4/0.8/0.8 mg”，有一定局限性。目前，關(guān)于滑膜炎制劑質(zhì)量研究的報道大多為單一成分HPLC 含量測定，如膠囊中粉防己堿［7］、顆粒/片劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷［8］等，尚未涉及多成分［9-12］。

中藥具有多成分、多靶點的特點，故僅靠單一成分評價模糊了其整體特征，脫離了臨床實際［13］。近年來，中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也逐步從單一向系統(tǒng)、整體評價轉(zhuǎn)變［14］，有助于在制劑原料環(huán)節(jié)進(jìn)行把控［15］，從而實現(xiàn)整體質(zhì)量批間一致性［16-18］。

課題組在質(zhì)譜鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合滑膜炎顆粒、膠囊、片劑中各成分在HPLC-UV 中的響應(yīng)值，篩選出迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參素、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸9 個差異標(biāo)志物。本實驗根據(jù)2020 年版《中國藥典》 方法，建立HPLC 法同時測定上述成分的含量，以期為滑膜炎制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考依據(jù)。

1 材料

Dionex Utimate 3000 高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器、CM7.2 色譜工作站［賽默飛世爾科技（中國） 有限公司］。BSA224S、SQP 電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；SB25-12DTD 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）； BY-400C-1 醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）。

丹參素鈉 （ 批號 110855-201925，純度97.8%）、原兒茶醛 （批號110810-201909，純度99.6%）、綠原酸 （批號110753-202018，純度96.1%）、咖啡酸 （批號110885-201703，純度99.7%）、迷迭香酸 （批號111871-202007，純度98.1%）、丹酚酸B （批號111562-201917，純度96.6%） 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。新綠原酸（批號P20A11L121936，純度≥98%）、隱綠原酸 （批號P16A10U95423，純度≥98%）、丹酚酸A （批號Z23D10X106625，純度≥98%） 對照品均購于上海源葉生物科技有限公司?；ぱ字苿┕?8 批，來自5 家公司，具體見表1。乙腈、磷酸為色譜純（美國Fisher 公司）； 甲醇為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）； 水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液

2.1.1.1 滑膜炎顆粒 取本品研細(xì)，精密稱取2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入75% 甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz） 處理20 min，取出，放冷，75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，移取10 mL 至離心管中，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.1.2 滑膜炎膠囊 精密稱取本品內(nèi)容物0.5 g，其余操作同“2.1.1.1” 項，即得。

2.1.1.3 滑膜炎片 將本品除去薄膜衣，研細(xì)，精密稱取0.5 g 或0.6 g，其余操作同“2.1.1.1”項，即得。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，75%甲醇制成分別含丹參素鈉0.377 1 μg/mL、新綠原酸0.076 1 μg/mL、原兒茶醛0.079 5 μg/mL、綠原酸0.250 7 μg/mL、隱綠原酸0.072 7 μg/mL、咖啡酸0.082 6 μg/mL、迷迭香酸0.279 7 μg/mL、丹酚酸B 0.400 4 μg/mL、丹酚酸A 0.385 9 μg/mL的貯備液，分別精密吸取1 mL，75%甲醇定容至10 mL，即得。

2.2 色譜條件 Xselect?HSS T3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～3 min，98% A； 3 ～12 min，98% ～90% A； 12 ～19 min，90% ～88% A； 19 ～28 min，88% ～86% A； 28 ～36 min，86% ～83% A；36～42 min，83% ～81%A； 42 ～72 min，81% ～77%A； 72 ～82 min，77% ～75% A； 82 ～100 min，75% ～65%A）； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃；檢測波長280、287、327 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取對照品溶液適量，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗 取“2.1.2” 項下對照品溶液適量，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得丹參素、新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 峰面積RSD 分別為1.51%、0.73%、0.58%、0.64%、0.99%、0.73%、0.66%、0.60%、0.21%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批顆粒適量，按“2.1.1” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得丹參素、新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 含量RSD 分別為1.44%、1.63%、2.49%、1.54%、2.27%、0.97%、1.17%、1.58%、0.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份顆粒的供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得丹參素、新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 峰面積RSD 分別為1.24%、0.63%、1.78%、1.24%、1.34%、1.25%、1.25%、0.87%、1.69%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的顆粒1.0 g，精密加入對照品溶液，按“2.1.1” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，丹參素、新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 平均加樣回收率分別為97.05%、98.56%、99.90%、99.37%、98.62%、97.80%、100.35%、98.85%、102.14%，RSD 分別為1.40%、2.59%、2.39%、1.25%、1.37%、1.41%、0.91%、1.50%、1.54%。

2.4 樣品含量測定 取10 批顆粒、10 批膠囊、18 批片劑，按“2.1.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表3～5。

表3 滑膜炎顆粒中各成分含量測定結(jié)果（mg/袋）Tab.3 Results for content determination of various constituents in Huamoyan Granules （mg/bag）

表4 滑膜炎膠囊中各成分含量測定結(jié)果（mg/粒）Tab.4 Results for content determination of various constituents in Huamoyan Capsules （mg/capsule）

表5 滑膜炎片中各成分含量測定結(jié)果（mg/片）Tab.5 Results for content determination of various constituents in Huamoyan Tablets （mg/tablet）

2.5 結(jié)果分析 各批制劑中丹酚酸B 含量均符合2020 年版《中國藥典》 要求（顆粒劑不得少于2.4 mg/袋，膠囊劑不得少于0.8 mg/粒，片劑不

得少于0.8 mg/片）。不同批次顆粒、膠囊中各成分含量RSD 分別小于5%、23%； B、C、D 公司片劑中各成分含量RSD 分別小于32%、45%、16%，而E 公司除了咖啡酸含量RSD 小于80%外，其他成分含量RSD 均小于45%。顆粒、膠囊、D 公司片劑批間RSD 較小，表明原料質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)過程控制水平較高； E 公司片劑中咖啡酸含量波動較大，可能與工藝參數(shù)的控制有關(guān)。

在同等生藥量（相當(dāng)于17.04 g 飲片） 下，對不同劑型、廠家樣品進(jìn)行比較，結(jié)果見表6，再對不同制劑中各成分綜合含量進(jìn)行評分，結(jié)果見表7。

表6 不同滑膜炎制劑中各成分含量測定結(jié)果（mg）Tab.6 Results for content determination of various constituents in different Huamoyan preparations （mg）

表7 不同滑膜炎制劑中各成分綜合含量評分（分）Tab.7 Scores for comprehensive contents of various constituents in different Huamoyan preparations （score）

綜上所述，同一廠家顆粒、膠囊中各成分含量，以及不同廠家片劑中大部分成分含量差異較大。根據(jù)2020 年版《中國藥典》 滑膜炎顆粒、膠囊、片劑項下內(nèi)容可知，顆粒和膠囊為同一廠家生產(chǎn)，雖然制法相似，但最終產(chǎn)品規(guī)格顯示兩者浸膏濃縮程度有所差異，可能與濃縮過程中受熱時間不同有關(guān)； 滑膜炎片由4 個廠家生產(chǎn)，其所含成分的含量差異可能來源于中間體制粒方式、稠膏濃縮程度、藥材來源不同。

3 討論

3.1 檢測波長歸屬 采用DAD 檢測器在190 ～360 nm 波長處進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)丹參素、原兒茶酸在280 nm 處均有最大吸收，丹酚酸B 在287 nm 處有最大吸收，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸在327 nm 處均有最大吸收。最終確定，檢測波長為280、287、327 nm。

3.2 指標(biāo)成分歸屬 課題組前期建立了滑膜炎制劑HPLC 指紋圖譜，共指認(rèn)出20 個特征峰，經(jīng)對照品比對鑒定出17 個，通過HCA、PCA、OPLSDA 等化學(xué)模式識別方法［19-22］篩選出迷迭香酸、丹酚酸B、丹參素等9 個差異標(biāo)志物。本實驗發(fā)現(xiàn)，丹參素、原兒茶醛主要存在于夏枯草和丹參中，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸主要存在于枸骨葉中，咖啡酸、迷迭香酸主要存在于夏枯草中，丹酚酸B、丹酚酸A 主要存在于丹參中，即各成分歸屬于不同藥材，可為滑膜炎制劑全面質(zhì)量控制提供參考。

3.3 數(shù)據(jù)分析 在含量測定時，均以滑膜炎制劑的最小包裝為單位，但不同品種最小包裝所對應(yīng)的生藥量不一致，故在同等生藥量下進(jìn)行比較。以各指標(biāo)成分含量排序為打分標(biāo)準(zhǔn)，第一計5 分，第二計4 分，第三計3 分，第四計2 分，第五計1 分，第六計0 分，若排名相等，則取2 個分值的平均值，最終得到綜合評分。