陶 香，張靜嫻，胡 青，孫 健，董 瑩，丁金國(guó)，于 泓，沈盈盈，毛秀紅，季 申*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203； 2.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 3.上海第一生化藥業(yè)有限公司，上海 200240）

瓜蔞皮注射液是以瓜蔞皮為原料，利用現(xiàn)代工藝制成的中藥注射液，具有行氣除滿、開胸除痹功效，常用于冠心病、穩(wěn)定型心絞痛、心力衰竭的治療［1-6］，具有改善心肌缺血、抗血栓、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用［7-9］。近年來，瓜蔞皮注射液臨床應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，在治療心、腦、肺等臟器疾病中發(fā)揮著重要作用，以因動(dòng)脈阻塞引起的心肌缺血缺氧性疾病居多［10-12］。

瓜蔞皮含有豐富的氨基酸，文獻(xiàn)［13］ 測(cè)定了不同產(chǎn)地、品系該藥材中18 種游離氨基酸的含量，發(fā)現(xiàn)高達(dá)37.71 mg/g； 文獻(xiàn)［14］ 在雙邊栝樓果實(shí)各部位中檢測(cè)了19 種氨基酸，其中果皮中含量較高的有瓜氨酸、精氨酸、賴氨酸等； 文獻(xiàn)［15-18］ 報(bào)道了瓜蔞皮經(jīng)水提醇沉、732 型陽離子交換樹脂后制成注射液，主要富集氨基酸、核苷、生物堿等兩性、堿性化合物，其中氨基酸含量最高。目前，瓜蔞皮注射液國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［19］采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總氨基酸含量，缺乏專屬性，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定瓜蔞皮注射液及其中間體中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸的含量，并考察其變化規(guī)律，以期為該制劑質(zhì)量控制關(guān)鍵因素研究提供參考。

1 材料

Agilent 1290 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）； Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）； 電子分析天平［0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； 精密PH 計(jì)（瑞士Mettler-Toledo公司）。鄰苯二甲醛（OPA） 購(gòu)自美國(guó)Pickering Laboratories 公司； 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC） 購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司； 巰基丙酸購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar 公司。氨基酸混合物（批號(hào)140624-201506，包括天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、賴氨酸） 及鳥氨酸（批號(hào)140847-201901）、瓜氨酸（批號(hào)110875-201607）、γ-氨基丁酸（批號(hào)100482-201601） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院，純度均≥98%。瓜蔞皮注射液共6 批，批號(hào)2205203 （編號(hào)SX1）、2206201 （編號(hào) SX2）、2206202 （編號(hào)SX3）、2205201 （編號(hào) SX4）、2205202 （編號(hào)SX5）、2206203 （編號(hào)SX6），經(jīng)水提醇沉、732 型陽離子交換柱等10 道工序后得到中間體，分別為煎煮合并液（編號(hào)Ⅰ）、減壓濃縮液（編號(hào)Ⅱ）、一次酒沉液（編號(hào)Ⅲ）、一次酒沉濃縮液（編號(hào)Ⅳ）、二次酒沉液 （編號(hào)Ⅴ）、二次酒沉濃縮液（編號(hào)Ⅵ）、氨水洗脫液（編號(hào)Ⅶ）、洗脫濃縮液（編號(hào)Ⅷ）、調(diào)酸冷藏過濾液（編號(hào)Ⅸ）、瓜蔞皮注射液制劑（編號(hào)Ⅹ），均由上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。乙腈、甲醇為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司； 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼酸均為分析純，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)） 上海化學(xué)試劑公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）； 流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液（pH＝7.8，制備方法為取磷酸氫二鈉71.8 g，超純水溶解并稀釋至1 000 mL； 取磷酸二氫鈉2.76 g，去離子水溶解并稀釋至100 mL，分別取兩者915、85 mL 混合，搖勻，即得） （A） - ［甲醇-乙腈-水（45 ∶45 ∶10） ］ （B），梯度洗脫（0 ～6 min，1% ～10% B； 6 ～20 min，10% ～38% B； 20 ～28 min，38% ～40%B）； 體積流量1 mL/min； 柱溫45 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)0～20 min 338 nm，20 min 后（即賴氨酸出峰后） 262 nm； 進(jìn)樣量1 μL。

衍生化試劑包括0.4 mol/L 硼酸緩沖液（pH ＝10.2），制備方法為取硼酸適量，制成0.4 mol/L溶液，40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至10.2，即得；1%OPA 溶液，制備方法為稱取OPA 80 mg，加硼酸緩沖液7 mL、乙腈1 mL、巰基丙酸125 μL，混勻，即得； 0.5% FMOC 溶液，制備方法為稱取FMOC 50 mg，適量乙腈-四氫呋喃（4 ∶6） 溶解，稀釋至10 mL，即得。柱前衍生化反應(yīng)中進(jìn)樣瓶1～4 分別為OPA、FMOC、水、硼酸鹽緩沖液，分別從瓶3 中吸取0 μL （水，清洗針頭）； 瓶4 中抽取7 μL （硼酸鹽緩沖液）； 吸取樣品1 μL； 瓶3 中吸取0 μL （水，清洗針頭）； “在空氣中” 以500 μL/min體積流量混合8 μL，共5 次； 瓶1 中吸取1 μL （OPA）； 瓶3 中吸取0 μL （水，清洗針頭）； “在空氣中” 以500 μL/min 體積流量混合9 μL，共25 次； 瓶2 中吸取1 μL （FMOC）； 瓶3中吸取0 μL （水，清洗針頭）； “在空氣中” 以500 μL/min 體積流量混合10 μL，共50 次； 進(jìn)樣。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品谷氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、鳥氨酸各12.5 mg，天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸各5 mg，γ-氨基丁酸25 mg，置于同一50 mL 量瓶中，0.1 mol/L 鹽酸溶解并稀釋至刻度，制成貯備液，分別精密量取適量，0.1 mol/L 鹽酸稀釋，即得（谷氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、鳥氨酸質(zhì)量濃度均為10～250 μg/mL，天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸質(zhì)量濃度均為4 ～100 μg/mL，γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為20～500 μg/mL）。

2.3 供試品溶液制備 分別精密移取瓜蔞皮注射液及其中間體（Ⅰ～Ⅹ） 3、1、3、1、3、1、1、1、1、1 mL 及同體積濃鹽酸，置于10 mL 安瓿瓶中，在150 ℃下水解1 h，放冷，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，10 mL 水分次洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L 鹽酸溶解并分別轉(zhuǎn)移至10、25、10、25、10、25、10、25、25、10 mL 量瓶中，0.1 mol/L 鹽酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y） 對(duì)其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各氨基酸在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各氨基酸線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various amino acids

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸峰面積RSD 分別為2.79%、0.74%、1.09%、1.29%、0.46%、2.03%、3.59%、1.98%、1.25%、1.95%、0.73%、2.79%、4.01%、3.08%、0.69%、1.24%、2.89%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液（SX1），在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸含量RSD 分別為2.37%、2.48%、3.39%、3.31%、3.87%、5.29%、2.08%、1.77%、1.76%、2.38%、3.30%、2.05%、0.98%、2.80%、2.65%、3.08%、3.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.3” 項(xiàng)下同一供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸峰面積RSD 分別為5.46%、3.28%、2.93%、5.18%、3.86%、3.40%、3.81%、4.19%、2.60%、2.31%、1.89%、4.71%、1.75%、3.51%、1.70%、3.87%、1.89%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取本品（SX1）0.5 mL，平行6 份，按100%水平加入對(duì)照品溶液，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸平均加樣回收率分別為118.32%、119.48%、110.13%、117.68%、100.60%、103.85%、107.18%、111.76%、84.60%、83.42%、112.51%、111.88%、85.76%、105.20%、113.28%、97.27%、103.07%，RSD 分別為1.68%、1.29%、2.14%、2.77%、1.48%、1.75%、7.94%、1.05%、3.93%、1.38%、3.91%、6.90%、2.53%、2.17%、0.91%、1.67%、7.83%。

2.5 樣品含量測(cè)定 圖1 顯示，瓜氨酸含量從中間體Ⅵ至Ⅶ明顯升高。再測(cè)定10 道工序相應(yīng)中間體中17 種氨基酸含量，結(jié)果見表2，可知中間體Ⅰ中精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸含量較高，酪氨酸、瓜氨酸含量較低； 制劑中γ-氨基丁酸、丙氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、瓜氨酸含量較高，酪氨酸、纈氨酸含量較低。

圖1 瓜蔞皮注射液制備工藝流程及代表性色譜圖Fig.1 Preparation process flow and typical chromatograms of Gualoupi Injection

表2 各氨基酸含量測(cè)定結(jié)果（μg/mL）Tab.2 Results for content determination of various amino acids （μg/mL）

2.6 主成分分析和熱圖分析 以10 道工序相應(yīng)中間體的樣品編號(hào)為變量，氨基酸含量的歸一化值為觀察值，采用 UV Scaling 方式預(yù)處理后通過SIMCA-P 13.0 軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖2。由此可知，前2 個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為70.2%； 相同工序不同批次樣品較聚集，表明工藝穩(wěn)定性較好； 不同工序樣品聚為3 組，分別為Ⅰ～Ⅱ（Group 1）、Ⅲ～Ⅵ（Group 2）、Ⅶ～Ⅹ（Group 3），表明工序Ⅲ、Ⅶ對(duì)氨基酸組成的影響最大，而工序Ⅶ后氨基酸組成非常相似，Group 3 中不同工序中間體難以區(qū)分； Ⅰ～Ⅱ中精氨酸、賴氨酸含量較高，而Ⅶ～Ⅹ中瓜氨酸、酪氨酸含量較高。

圖2 主成分分析結(jié)果Fig.2 Results for principal component analysis

熱圖分析見圖3。由此可知，氨基酸含量聚為3 類，與主成分分析結(jié)果基本一致； 以工序Ⅶ為分界點(diǎn)，精氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸在制備過程中的含量由高轉(zhuǎn)低，而脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸含量恰好相反； 鳥氨酸含量由高轉(zhuǎn)低又升高，瓜氨酸在工序Ⅰ中的含量略高，Ⅱ～Ⅵ中非常低，Ⅶ中開始明顯升高； 酪氨酸含量從工序Ⅶ開始逐漸升高，最終趨于穩(wěn)定。

綜上所述，工序Ⅶ對(duì)氨基酸組成的影響最大。732 型陽離子交換柱的填料為7%苯乙烯·二乙烯共聚體上帶有磺酸基（-SO3） 的陽離子交換樹脂，在溶液中解離出H＋，樹脂解離后產(chǎn)生的SO3-能與溶液中帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合，主要用于富集堿性物質(zhì)或強(qiáng)酸性物質(zhì)。瓜蔞皮煎煮液水提醇沉后主要富集了多肽、氨基酸、核苷等親水性化合物，與離子交換劑的結(jié)合能力主要取決于其物理化學(xué)性質(zhì)和等電點(diǎn)，pH＜pI，氨基酸和多肽帶正電； pH＞pI，兩者帶負(fù)電［20］，并且環(huán)境pH 與等電點(diǎn)差值越大，與離子交換劑的結(jié)合能力越強(qiáng)； 被分離肽的電荷密度越大，與離子交換劑的結(jié)合能力也越強(qiáng)，以1 mol/L氨溶液（pH 約9.25） 洗脫陽離子交換柱時(shí)，pI＞pH 的氨基酸和多肽帶正電，與樹脂交換基團(tuán)中的H＋發(fā)生交換而結(jié)合于柱上，如賴氨酸、精氨酸； pI＜pH 的兩者帶負(fù)電，無法與離子交換柱結(jié)合而被氨溶液洗脫下來，如脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸等，同時(shí)一些帶正電荷、密度較大的肽與樹脂交換基團(tuán)中的H＋發(fā)生交換，結(jié)合于柱上，而帶負(fù)電荷的肽被洗脫下來。另外，瓜氨酸通過陽離子交換柱后含量明顯升高，結(jié)合文獻(xiàn)［21］ 報(bào)道，推測(cè)可能是由于氨水洗脫過程中精氨酸在有氧條件下氧化生成瓜氨酸和一氧化氮，最后被富集到制劑中，從而使該成分含量大大增加。

3 討論

3.1 氨基酸篩選 預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇20 種氨基酸進(jìn)行色譜條件考察，發(fā)現(xiàn)組氨酸、甲硫氨酸、色氨酸含量較低，衍生試劑在相應(yīng)色譜峰處有干擾，影響結(jié)果準(zhǔn)確性，故未測(cè)定三者； 在谷氨酸、甘氨酸色譜峰之間存在一個(gè)較大的未知峰，對(duì)比空白試劑色譜圖發(fā)現(xiàn)并非衍生試劑峰，并且經(jīng)谷氨酰胺、天冬酰胺、羥脯氨酸、組氨酸、甲硫氨酸等對(duì)照品比對(duì)后也均不符合，后期將繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。

3.2 衍生條件優(yōu)化 衍生化法檢測(cè)氨基酸是在一定pH 和3-巰基丙酸（3-MPA） 存在下，OPA 首先與一級(jí)氨基酸反應(yīng)，而二級(jí)氨基酸不與OPA 反應(yīng)，與3-MPA 結(jié)合后可降低氨基酸疏水性，再用FMOC 對(duì)二級(jí)氨基酸脯氨酸進(jìn)行衍生，故OPA 衍生化產(chǎn)物出峰時(shí)間比FMOC 衍生化產(chǎn)物更早，而過剩的FMOC 及其降解產(chǎn)物在二級(jí)氨基酸后出峰，不會(huì)干擾分析［22］。本實(shí)驗(yàn)考察了OPA、FMOC 在500 μL/min 速率下混合5、10、20、25、50、70、100 次時(shí)的衍生氨基酸峰面積，最終分別確定為25、50 次。

3.3 水解條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，一般在150 ℃下水解60 min 即可將結(jié)合氨基酸全部水解為游離型氨基酸，再對(duì)常用水解時(shí)間（30、60、90 min） 進(jìn)行考察，為了確保注射液中結(jié)合型氨基酸全部水解，最終確定為60 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用OPA-FMOC 在線衍生法測(cè)定瓜蔞皮注射液中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸的含量，具有良好的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，對(duì)提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供重要方法。然后，對(duì)10 道工序相應(yīng)中間體中上述氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，并開展主成分分析和熱圖分析，闡釋生產(chǎn)過程中其變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)醇沉和陽離子交換樹脂對(duì)其組成的影響最大，可為指導(dǎo)優(yōu)化瓜蔞皮注射液生產(chǎn)工藝提供科學(xué)依據(jù)。