陳金平 劉志鳳 于天源 王厚融 張英琦 楊震杰 薩出拉 官乾 徐亞靜 張潤(rùn)龍 張漢鈺 劉家玥 孫佳偉

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是由于軀體感覺(jué)系統(tǒng)病變或者疾病導(dǎo)致的疼痛[1-2],其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,治療效果欠佳,根據(jù)損傷部位可分為周?chē)蜕窠?jīng)病理性疼痛(peripherally-induced neuropathic pain,pNP)與中樞型神經(jīng)病理性疼痛,其中pNP臨床發(fā)病率較高[3]。脊髓背角作為第二級(jí)神經(jīng)元,在pNP后對(duì)痛覺(jué)、溫度覺(jué)信息的傳導(dǎo)以及最終形成痛覺(jué)的過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用[4]。

推拿在pNP臨床治療中效果確切。課題組前期通過(guò)RNA-seq技術(shù)探究推拿鎮(zhèn)痛相關(guān)機(jī)制,發(fā)現(xiàn)推拿長(zhǎng)期及早期鎮(zhèn)痛可能與白介素-17(interleukin-17)信號(hào)通路關(guān)系密切[5-6],pNP可引起IL-17信號(hào)表達(dá)異常。因此,對(duì)該通路中的關(guān)鍵指標(biāo)白介素-17A(interleukin 17A,IL-17A)、白介素-17A受體(interleukin-17A receptor, IL-17RA)與轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(transcription factor CCAAT/enhancer binding protein β, C/EBPβ)進(jìn)行研究。本研究建立輕度坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(Minor chronic compression injury of sciatic nerve, Minor CCI)模型大鼠,通過(guò)機(jī)械縮足反射閾值(paw mechanical withdraw threshold,PMWT)與冷敏閾值(cold sensitivity threshold, CST)觀察干預(yù)1次后大鼠痛、溫覺(jué)的恢復(fù)情況,并通過(guò)蛋白免疫印跡法(western bolt, WB)檢測(cè)L4～6脊髓背角中IL-17A與C/BEPβ表達(dá),通過(guò)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)IL-17A/RA與C/BEPβmRNA表達(dá),對(duì)推拿早期鎮(zhèn)痛啟動(dòng)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量(200±10)g,購(gòu)買(mǎi)于斯貝福(北京)生物科技有限公司,許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK(京)2020-0033],3只/籠,環(huán)境溫度為(25±1)℃,相對(duì)濕度(50±5)%,晝夜節(jié)律,大鼠自由進(jìn)食,每周更換墊料2次。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)批準(zhǔn)(BUCM-4-2022082601-3039),符合動(dòng)物福利與倫理原則。

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,通過(guò)電子測(cè)痛儀(BIO-EVF5)篩選痛閾值均一的大鼠,并通過(guò)隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和推拿組,每組8只。

1.2 主要儀器與試劑

儀器:按摩推拿手法模擬儀(專(zhuān)利號(hào)200710187403.1),VonFrey電子測(cè)痛儀(BIO-EVF5,生產(chǎn)廠家BIOSEB),小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)(美國(guó)SurgiVet公司),電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司),MultiSkan3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司),電動(dòng)組織勻漿器(美國(guó)FLUKA公司),Spectra Max Quick Drop型超微量分光光度計(jì)(上海美谷分子儀器有限公司),AG 22331 Hamburg PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司),CFX96TM Optics Module實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司),凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

試劑:兔用IL-17A抗體(生產(chǎn)批號(hào):BA11232558)、兔用C/EBPβ抗體(生產(chǎn)批號(hào):AG06299152),彩虹預(yù)染蛋白marker(生產(chǎn)批號(hào):BB10198356),以上試劑均訂購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;高效組織裂解液(生產(chǎn)批號(hào):20221020),BSA標(biāo)準(zhǔn)品(生產(chǎn)批號(hào):20221009),5×蛋白上樣緩沖液(生產(chǎn)批號(hào):20221110),以上試劑均訂購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):RLB23-01),cDNA第一鏈合成試劑盒(美國(guó)Thermo公司,生產(chǎn)批號(hào):01157375)。

1.3 造模及干預(yù)方法

1.3.1 造模 根據(jù)課題組前期研究成果進(jìn)行造模[7],造模前12小時(shí)禁食、禁水,模型組與推拿組制備Minor CCI模型大鼠模擬臨床pNP。模型組、推拿組造模方法:使用異氟烷對(duì)大鼠進(jìn)行氣體麻醉,待大鼠完全麻醉后,將大鼠取出并按俯臥位固定在鼠板上,將右側(cè)髖股交界區(qū)剃毛、消毒;沿坐骨神經(jīng)體表投影區(qū)切1 cm切口,鈍性分離,暴露坐骨神經(jīng);在坐骨神經(jīng)游離處7 mm用鉻制4-0可吸收性外科縫線結(jié)扎,結(jié)扎度不可過(guò)緊,避免影響神經(jīng)外膜血流,結(jié)扎完成后對(duì)組織逐層縫合,滴入適量消炎藥與生理鹽水,避免術(shù)后傷口感染。假手術(shù)組造模:只剝離暴露出坐骨神經(jīng),不進(jìn)行結(jié)扎,其余步驟同模型組與推拿組。

1.3.2 干預(yù)方法 術(shù)后7天開(kāi)始干預(yù),干預(yù)前需適應(yīng)環(huán)境30分鐘,待大鼠安靜后開(kāi)始干預(yù),干預(yù)期間保持安靜。假手術(shù)組與模型組:將大鼠仰臥位束縛于鼠板上束縛9分鐘。推拿組:使用按摩推拿手法模擬儀依次對(duì)患側(cè)殷門(mén)穴、承山穴、陽(yáng)陵泉穴分別實(shí)行點(diǎn)、撥、揉法[8],每穴1分鐘/法,參數(shù)設(shè)置:力度10 N,頻率60次/分鐘。

1.3.3 行為學(xué)檢測(cè) 分別于造模前、干預(yù)前1天以及干預(yù)后即刻進(jìn)行機(jī)械刺激及冷板實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)檢測(cè)。

1.3.4 PMWT 通過(guò)PWMT對(duì)大鼠痛覺(jué)敏化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。提前20分鐘將大鼠放置于箱底部放置網(wǎng)格鐵絲網(wǎng)透明玻璃箱內(nèi),待其停止探索活動(dòng)后,使用VonFrey電子機(jī)械測(cè)痛儀,將刺激探頭對(duì)準(zhǔn)大鼠足底部進(jìn)行刺激,逐步增加刺激量,每次刺激間隔時(shí)長(zhǎng)不低于10分鐘,當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮足、舔足時(shí)記錄數(shù)值。

1.3.5 CST 通過(guò)CST對(duì)大鼠溫度覺(jué)敏化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。將大鼠放置于表面溫度為(4±1)℃的冷板上適應(yīng)5分鐘,上方罩一有機(jī)玻璃罩限制其活動(dòng)范圍,待大鼠停止探尋活動(dòng)后,記錄其5分鐘內(nèi)縮足、舔足的次數(shù)。大鼠活動(dòng)及體位變化引起的抬足不記入。

1.4 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 取材 干預(yù)完成,行為學(xué)測(cè)試完畢后,每組隨機(jī)選取6只大鼠,使用濃度為10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉,取L4～L6節(jié)段脊髓背角。

1.4.2 WB檢測(cè)脊髓背角中IL-17A、C/EBPβ的蛋白表達(dá) 取適量脊髓背角組織放于EP管中,并加入組織裂解混合液(PMSF∶RIPA=1∶100;樣本重量:組織裂解液=1∶10),將EP管置于冰上,將脊髓組織研磨至肉眼不可見(jiàn),每次震蕩10分鐘,共4次。混合液4℃、12 000 r/min離心20分鐘,吸取上清液,避免吸到沉淀。37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育25分鐘,酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度并計(jì)算樣本上樣量,加5×蛋白上樣緩沖液并混勻,95℃變性5分鐘。

配12%的分離膠及5%的濃縮膠,上樣后穩(wěn)定電泳分離膠60V、20分鐘;分離膠80V、90分鐘?？燹D(zhuǎn)400 mA、25分鐘,快速封閉液封閉20分鐘。根據(jù)marker裁膜,一抗(IL-17A 1∶1 000,C/EBPβ 1∶1 000,β-actin 1∶5 000)室溫?fù)u床1小時(shí)后,4攝氏度過(guò)夜。1×PBST洗膜3次,二抗(辣根酶山羊抗兔Ig G1∶10 000)搖床1小時(shí),顯影液均勻滴在膜上后進(jìn)行顯影。

1.4.3 RT-PCR檢測(cè)脊髓背角中IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ的mRNA表達(dá) 在超凈臺(tái)環(huán)境中取適量脊髓背角組織,用組織細(xì)胞RNA提取盒對(duì)組織RNA進(jìn)行提取后,使用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列號(hào):GAPDH上游引物:ATGACTCTACCCACGGCAAG,下游引物:TACTCAGCACCAGCATCACC;IL-17A上游引物:TGCCTGATGCTGTTGCTGCTAC,下游引物:GCGTTTGGACACACTGAACTTTGAG;C/EBPβ上游引物:GCTGAGCGACGAGTACAAGATGC,C/EBPβ下游引物:CTTGTGCTGCGTCTCCAGGTTG;IL-17RA上游引物:CCATAACAGCCGCAGACTATATTCC,下游引物:GCAGATAATCAGCAGGATGACAGAG。擴(kuò)增完成后根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PMWT結(jié)果

PMWT基線:假手術(shù)組、模型組與推拿組相比,無(wú)顯著性差異(P>0.05);干預(yù)前:模型組、推拿組低于假手術(shù)組(P<0.01),模型組與推拿組無(wú)顯著性差異(P>0.05);干預(yù)后:模型組與推拿組低于假手術(shù)組(P<0.01),推拿組高于模型組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠PMWT結(jié)果

2.2 各組大鼠CST結(jié)果

CST基線:模型組、推拿組與假手術(shù)相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);干預(yù)前:模型組高于假手術(shù)組(P<0.01),推拿組高于假手術(shù)組(P<0.05);干預(yù)后:模型組高于假手術(shù)組(P<0.01),推拿組與假手術(shù)組無(wú)顯著差異(P>0.05),模型組高于推拿組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠冷板實(shí)驗(yàn)抬足次數(shù)結(jié)果次)

2.3 各組大鼠IL-17A、C/EBPβ蛋白表達(dá)量比較

IL-17A:干預(yù)后,模型組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.05),推拿組與假手術(shù)組無(wú)顯著性差異(P>0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。

C/EBPβ:干預(yù)后,模型組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.05),推拿組與假手術(shù)組無(wú)顯著性差異(P>0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

注:J為假手術(shù)組,M為模型組,T為推拿組。

表3 各組大鼠IL-17A、C/EBPβ蛋白表達(dá)量

2.4 各組大鼠IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ的mRNA表達(dá)比較

IL-17A mRNA:干預(yù)后,模型組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.01),推拿組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。

IL-17RA mRNA:干預(yù)后,模型組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.01),推拿組與假手術(shù)組無(wú)顯著性差異(P>0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。

C/EBPβ mRNA:干預(yù)后,模型組、推拿組均高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.01),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ的mRNA結(jié)果

3 討論

前期實(shí)驗(yàn)證明,“三法三穴”推拿手法干預(yù)后可有效恢復(fù)大鼠超微結(jié)構(gòu),改善自發(fā)性疼痛、提高痛閾及溫度覺(jué)的恢復(fù)等[9-12],但尚不清楚推拿如何啟動(dòng)鎮(zhèn)痛。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5-6],驗(yàn)證IL-17A/IL-17RA/C/EBPβ信號(hào)通路在干預(yù)1次后即刻的鎮(zhèn)痛作用及其啟動(dòng)鎮(zhèn)痛的相關(guān)機(jī)制。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn),推拿干預(yù)1次后可抑制IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ mRNA在脊髓背角的表達(dá)(P<0.05);同時(shí)也可抑制IL-17A、C/EBPβ蛋白在脊髓背角的表達(dá)(P<0.05),發(fā)揮即刻鎮(zhèn)痛作用。

3.1 Minor CCI模型適合模擬pNP的早期研究

Minor CCI模型模擬臨床pNP,適合短期研究設(shè)計(jì)。前期研究證實(shí),相較于經(jīng)典CCI模型,Minor CCI與經(jīng)典CCI模型在機(jī)械縮足痛閾趨勢(shì)保持一致,且模型更加穩(wěn)定,自殘現(xiàn)象更少[7]。而經(jīng)典CCI模型則會(huì)出現(xiàn)不同程度的自殘現(xiàn)象,同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生異常的熱性痛覺(jué)亢進(jìn),但熱性痛覺(jué)過(guò)敏并不是臨床中NP的表現(xiàn)之一[13]。因此選擇Minor CCI模型作為本次實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,能避免因模型損傷過(guò)重,在早期研究中出現(xiàn)效果不明顯的情況,同時(shí)本實(shí)驗(yàn)根據(jù)臨床患者出現(xiàn)疼痛以及怕冷的臨床表現(xiàn)[14],對(duì)機(jī)械痛覺(jué)以及對(duì)冷敏化程度進(jìn)行研究。

根據(jù)行為學(xué)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),造模后,模型組與推拿組的痛閾值明顯低于假手術(shù)組(P<0.01),表現(xiàn)經(jīng)典,提示造模成功。而在“三法三穴”推拿手法干預(yù)1次后,推拿組較模型組在PMWT以及CST可出現(xiàn)較為明顯的改善(P<0.01)。比較有趣的一點(diǎn)是推拿組相較于假手術(shù)組的CST無(wú)顯著性差異(P>0.05),與PMWT相比,CST數(shù)據(jù)較不穩(wěn)定,樣本之間差異較大。針對(duì)該結(jié)果,主要考慮有以下幾點(diǎn):首先是個(gè)體差異性,個(gè)體樣本之間的表現(xiàn)在機(jī)械痛閾上隨保持一致,但在對(duì)冷的感受上則不一致,該現(xiàn)象與臨床患者表現(xiàn)一致;另一點(diǎn)考慮則是超出推拿即刻鎮(zhèn)痛作用維持的時(shí)效,但該觀點(diǎn)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。基于行為學(xué)結(jié)果,證實(shí)推拿1次既可發(fā)揮即刻鎮(zhèn)痛作用又可改善冷敏化狀況。

3.2 IL-17A與NP關(guān)系密切

IL-17A主要是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生,介導(dǎo)炎癥及自身免疫性疾病[15]。IL-17可通過(guò)間接招募損傷神經(jīng)元區(qū)域中的免疫細(xì)胞,進(jìn)而釋放炎性因子,參與NP的發(fā)生與發(fā)展[16-17]。受損區(qū)域神經(jīng)元中IL-17A表達(dá)上調(diào)的同時(shí),可通過(guò)其受體IL-17RA將信號(hào)傳遞給感覺(jué)神經(jīng)元,從而促進(jìn)神經(jīng)再生[18]。IL-17可直接或間接激活神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,釋放多種炎癥介質(zhì)及趨化因子進(jìn)而對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生損害[19-20]。CCI造模后第3天,背根神經(jīng)節(jié)中C/EBPβ表達(dá)升高,可引起自發(fā)性疼痛、機(jī)械性痛閾以及溫度覺(jué)的敏化,而當(dāng)抑制C/EBPβ的表達(dá)時(shí)則可緩解其敏化癥狀[21]。C/EBPβ過(guò)多表達(dá)可促使脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化,加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng)[22]。因此,抑制IL-17A/RA的結(jié)合及其下游的傳導(dǎo),可能成為治療pNP新思路[23],但目前還未有相關(guān)研究在IL-17A介導(dǎo)的C/EBPβ通路在pNP早期進(jìn)行研究,因此本實(shí)驗(yàn)基于上述理論進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示,相較于模型組,推拿干預(yù)后可抑制脊髓背角中IL-17A/RA表達(dá)(P<0.05),并且抑制了下游通路中C/EBPβ mRNA與蛋白的表達(dá)(P<0.05),從而發(fā)揮即刻止痛的作用,此結(jié)果與前人認(rèn)為的IL-17A/RA為潛在性治療靶點(diǎn)的相關(guān)研究成果吻合[24]。因此可以認(rèn)為推拿干預(yù)1次后可通過(guò)抑制IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)早期鎮(zhèn)痛。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)揭示了“三法三穴”推拿手法干預(yù)即刻便可有效緩解因pNP導(dǎo)致的疼痛,其啟動(dòng)機(jī)制與抑制IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ信號(hào)通路有關(guān)。但是本實(shí)驗(yàn)還存在一定局限性,如未驗(yàn)證干預(yù)1次后鎮(zhèn)痛效果的維持時(shí)長(zhǎng),尤其是對(duì)冷敏化情況的研究。此外,也未對(duì)早期鎮(zhèn)痛過(guò)程中脊髓背角IL-17A對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響進(jìn)行研究,后期實(shí)驗(yàn)可從這兩方面入手進(jìn)一步驗(yàn)證,為臨床推拿治療pNP提供更多證據(jù),為推拿學(xué)的發(fā)展提供科學(xué)支撐。