劉家光

（福建正味生物科技有限公司，福建 福州 350015）

0 引言

鰻魚的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高，被稱作是水中軟黃金，有“水中人參”之美譽(yù)[1,2]，2020年全國(guó)養(yǎng)殖鰻魚高達(dá)25.07萬(wàn)t[3]。鰻魚是福建重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，其含肉率高，肉質(zhì)細(xì)滑，多以烤鰻的形式出口，然而在烤鰻的工業(yè)化深加工過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的邊角料，如鰻魚頭、鰻魚內(nèi)臟、鰻魚骨等[4]。歐洲鰻魚的魚骨占鰻魚質(zhì)量10%以上，是鰻魚加工主要副產(chǎn)物之一[5,6]，但是，這些低值邊角料蘊(yùn)含著豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別鰻魚骨是一種高級(jí)的營(yíng)養(yǎng)食品，除蛋白質(zhì)、氨基酸[7]和碳水化合物外，鈣、磷、鐵等多種無(wú)機(jī)鹽的含量也很高，鋅和硒含量相對(duì)較高[8]。然而，鰻魚被取肉后剩下骨頭又硬又鋒利，很難被食用，只有部分被簡(jiǎn)單加工為骨粉添加到附加價(jià)值不高的普通魚飼料中，多數(shù)鰻魚骨頭都被作為廢棄物，這樣既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。

有效地對(duì)這些低值的鰻魚下腳料進(jìn)行精深加工并實(shí)現(xiàn)其高值化，是我們必須重視和解決的問題。鰻魚骨可以加工成飼料魚粉，提取膠原蛋白，提取可溶性鈣，制成保健食品、調(diào)味品等。本研究利用生物復(fù)合酶解技術(shù)對(duì)鰻魚骨進(jìn)行酶解，將低值的鰻魚骨下腳料處理加工成富含骨膠原、多肽及氨基酸等功能因子的提取物產(chǎn)品，將酶解產(chǎn)物進(jìn)行美拉德反應(yīng)，利用調(diào)配、真空濃縮等技術(shù)開發(fā)生產(chǎn)出口感風(fēng)味俱佳的鰻魚風(fēng)味調(diào)味品。

本研究成果可以在餐飲、調(diào)味品、冷凍調(diào)理食品、香精、海鮮制品等領(lǐng)域作為安全的食品配料廣泛應(yīng)用，鰻魚風(fēng)味調(diào)味品是一種具有發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景的食品添加劑，可以為鰻魚下腳料的高值化利用提供參考，提高鰻魚產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮鰻魚骨[勝田（福清）食品有限公司]；酶制劑（風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶）——夏盛(北京)生物科技開發(fā)有限公司；鹽酸（濟(jì)南佰科化工有限公司）；氫氧化鈉（濱化集團(tuán)股份有限公司）；木糖（河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司）。以上均符合相關(guān)產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

LC-WB-4 恒溫水浴鍋(上海皓莊儀器有限公司)；TB-430振篩器(佛山市順德區(qū)天博機(jī)械有限公司)；PH-100B酸度計(jì)上海力辰儀器科技有限公司；DT-200槽型混合機(jī)(上海力辰儀器科技有限公司)；JJ-2 FK-A型組織搗碎勻漿機(jī)(上海鑫翁科學(xué)儀器有限公司)；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海耀特儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 鰻魚骨酶解提取物工藝流程

原料選擇→清洗（去血水）→切斷、搗碎→酶解→滅酶→過濾→真空濃縮→成品

1.3.2 鰻魚骨酶解濃縮液加工工藝操作要點(diǎn)

1.3.1.1 原料的選擇及預(yù)處理⑴ 原料的選擇：選擇新鮮的鰻魚骨（歐洲鰻），天氣熱需放冷庫(kù)低溫冷藏，防止變質(zhì)。

⑵ 預(yù)處理：新鮮的鰻魚骨用流動(dòng)水進(jìn)行漂洗30 min去血水，切成2 cm的小段，放入搗碎機(jī)中攪碎備用。

1.3.3.2 鰻魚骨酶解濃縮液的制備流程

根據(jù)之前的確定的酶解工藝制備鰻魚骨酶解濃縮液。鰻魚骨酶解濃縮液的酶解工藝參數(shù)為：蛋白酶質(zhì)量為0.1%（復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1∶1）、料液比1∶1（g/mL）、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間5 h。酶解結(jié)束后將酶解液升溫至96 ℃保持10 min滅去酶活性，60目過濾篩將酶解液濾出，除去酶解液的上層油脂，剩余骨渣丟棄。采用真空濃縮法（真空度-95 kPa，濃縮溫度55 ℃），將得到的鰻魚骨酶解液進(jìn)行真空預(yù)處理，使其濃縮為原來(lái)體積的20%，從而獲得鰻魚骨酶解濃縮液。

1.3.3 美拉德反應(yīng)改良工藝參數(shù)優(yōu)化

⑴ 單因素試驗(yàn)

考察木糖添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、反應(yīng)溫度（90、100、110、120、130 ℃）、反應(yīng)時(shí)間（30、40、50、60、70 min）、pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對(duì)美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物風(fēng)味模糊綜合感官評(píng)分的影響。

⑵ 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以pH值（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）、木糖添加量加量（D）為主要因素為考察因素，選取模糊綜合感官評(píng)分為指標(biāo)，按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物風(fēng)味優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.4 感官評(píng)價(jià)方法

由有食品相關(guān)專業(yè)教育背景專業(yè)人員10人（5男5女）組成評(píng)定小組，為提高感官評(píng)價(jià)的可信度，在評(píng)定之前不得使用有氣味的化妝品，1 h不得抽煙等。分別對(duì)美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物的外觀、滋味、氣味及色澤進(jìn)行等級(jí)評(píng)定，等級(jí)分為差、中、良、優(yōu)四個(gè)等級(jí)，按百分制評(píng)分，感官質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.3.5 建立模糊綜合感官評(píng)價(jià)模型

⑴ 因素集、評(píng)語(yǔ)集和加權(quán)重集的建立

因素集是影響被評(píng)價(jià)對(duì)象的指標(biāo)集合，參照韓曉江等[9]的方法建立以外觀(U1)、滋味(U2)、氣味(U3)、色澤(U4)作為美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物的評(píng)價(jià)指標(biāo)的模糊綜合感官評(píng)價(jià)模型，從而得到的因數(shù)集U={u1，u2，u3，u4}。

評(píng)語(yǔ)集是指參與美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物感官質(zhì)量的評(píng)價(jià)者對(duì)其評(píng)價(jià)反饋信息的集合，確定評(píng)語(yǔ)論域需要評(píng)定的等級(jí)。經(jīng)過評(píng)定全體成員討論，確定美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物的評(píng)價(jià)等級(jí)為優(yōu)(n1)、良(n2)、好(n3)、差(n4)，得到美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物的評(píng)語(yǔ)集N=｛n1，n2，n3，n4｝。評(píng)價(jià)過程中差優(yōu)、良、中和差4個(gè)等級(jí)分別賦予相應(yīng)的分值90、80、70、60，則評(píng)價(jià)等級(jí)集K={K1，K2，K3，K4}={90，80，70，60}。

⑵ 確定權(quán)重集

根據(jù)譚沙等[10]的方法，權(quán)重是指評(píng)價(jià)因素對(duì)模糊數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)的重要程度，表示為X=(x1，x2，x3，x4)，外觀、滋味、氣味及色澤是影響美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物感官品質(zhì)的指標(biāo)。該試驗(yàn)采用強(qiáng)制規(guī)定法確定各因素的權(quán)重分別為外觀(0.20)、滋味(0.35)、氣味(0.30)、色澤(0.15)即權(quán)重集X=(0.20，0.35，0.30，0.15)。

⑶ 建立模糊綜合感官評(píng)判

模糊感官綜合評(píng)價(jià)結(jié)果為Yi=X×Ri（i為1-9），其中X為權(quán)重集，Ri為模糊矩陣；并引進(jìn)綜合評(píng)分矩陣T處理模糊關(guān)系評(píng)價(jià)集Y，得到美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物樣品的模糊綜合評(píng)價(jià)總分T=Y×K，其中K={k1，k2，k3，k4}為評(píng)價(jià)等級(jí)集。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 木糖添加量對(duì)鰻魚骨酶解液美拉德反應(yīng)的影響

美拉德反應(yīng)是食品風(fēng)味產(chǎn)生的主要來(lái)源之一，還原糖添加量影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的色澤和香味。木糖反應(yīng)活性較好，價(jià)格便宜，能促進(jìn)目標(biāo)物的甜味和焦糖香產(chǎn)生。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，由圖可知，添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%木糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，隨著木糖添加量的增加，在波長(zhǎng)280 nm與420 nm處的吸光度也隨之增加。通過感官評(píng)分顯示，當(dāng)木糖添加量為2.0%時(shí)，其感官評(píng)分最高，木糖添加量超過2.0%之后感官評(píng)分開始下降，而木糖添加量超過2.0%時(shí)，焦糖化反應(yīng)加劇，褐變急速加劇和產(chǎn)生焦苦味使感官評(píng)分降低。當(dāng)木糖加入量增加，其反應(yīng)速度加快，當(dāng)添加量過多時(shí)其反應(yīng)不徹底，而在感官上有明顯的甜味和略帶焦苦的味道，顏色偏深，因此從各個(gè)方面來(lái)看，確定最佳的木糖的添加量為2.0%。

圖1 木糖添加量對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分的影響

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)鰻魚骨酶解液美拉德反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，由圖可知：在90、100、110、120、130 ℃的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，隨著反應(yīng)溫度的升高，在波長(zhǎng)280 nm與420 nm處吸光度隨之增加，感官評(píng)分也逐漸增加，在110 ℃達(dá)到最高值；當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)大于110 ℃時(shí)，低分子質(zhì)量香味中間體含量較高，其感官評(píng)分逐步下降，280 nm處吸光度也隨之下降，這可能是美拉德反應(yīng)速度大幅提高，類黑精物質(zhì)產(chǎn)生加速，掩蓋了原有的海鮮風(fēng)味[11,12]，并呈現(xiàn)出焦苦味，顏色呈褐色,對(duì)感官評(píng)分有不利影響,所以將110℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)鰻魚骨酶解液美拉德反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，由圖可知在30、40、50、60、70 min的反應(yīng)時(shí)間條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，在波長(zhǎng)280 nm和420 nm處的吸光度都與反應(yīng)時(shí)間成正比，酶解液顏色也隨之加深，這說明美拉德反應(yīng)的程度也隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，這與董志儉等[13]和李學(xué)鵬[14]的研究結(jié)果相同。然而，感官評(píng)分逐步升高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分達(dá)到最高，反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味和質(zhì)量最佳，但隨著反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物的褐變進(jìn)一步增加，顏色也進(jìn)一步變深，出現(xiàn)焦苦味較明顯，風(fēng)味不佳，分?jǐn)?shù)下降。因此確定最佳的反應(yīng)時(shí)間為50 min。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分的影響

2.1.4 反應(yīng)體系初始pH值對(duì)鰻魚骨酶解液美拉德反應(yīng)的影響

反應(yīng)初始pH值對(duì)美拉德反應(yīng)體系有著很大的影響，如氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)等含有的氨基和還原糖中的羰基，在不同的pH值下，形成離子化程度不一樣，使其風(fēng)味差異較大；在反應(yīng)pH值過高的情況下，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物顏色變深，在感官上有一種焦糊味。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，由圖可知在反應(yīng)pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，隨著pH值的增加，酶解液的褐變顏色加深，美拉德反應(yīng)的感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)pH值為7.0時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大。在反應(yīng)pH值為6.0～7.5的條件下，低分子質(zhì)量的香味中間體增加；當(dāng)反應(yīng)pH＞7.5時(shí)，香味中間體含量下降。隨著pH值的升高，鰻魚骨酶解液會(huì)產(chǎn)生焦糊味，并使其顏色變深，使感官評(píng)分降低，結(jié)果顯示pH值對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度有著很大的影響。因此確定最佳的反應(yīng)體系初始pH值為7.0。

圖4 初始pH值對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分的影響

2.2 模糊數(shù)學(xué)綜合感官評(píng)價(jià)結(jié)果

通過評(píng)定小組感官評(píng)價(jià)員對(duì)9個(gè)美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物樣品的外觀、滋味、氣味及色澤4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，將評(píng)價(jià)結(jié)果收集匯總并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物的感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表3。

表3 不同配料下美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物感官評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3 模糊矩陣模型建立的結(jié)果

模糊矩陣是根據(jù)感官評(píng)價(jià)中各評(píng)語(yǔ)得票數(shù)比評(píng)價(jià)總?cè)藬?shù)，那么根據(jù)感官評(píng)價(jià)結(jié)果得到9個(gè)模糊矩陣Ri，其中i代表第i個(gè)樣本。例如以1號(hào)樣本為例，得到表4所示的感官評(píng)價(jià)結(jié)果，則樣品1的矩陣為：

表4 美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

同理可得R2-R9。采用先相乘再加和的方法計(jì)算綜合評(píng)分，根據(jù)確定權(quán)重集X=(0.2，0.3，0.3，0.2)。對(duì)模糊感官的綜合評(píng)定結(jié)果Yi=X×Ri（i為1-9）。例如以樣品1為例，其模糊感官評(píng)價(jià)結(jié)果：

同理可得Y2-Y9樣品的模糊數(shù)學(xué)感官綜合評(píng)價(jià)結(jié)果。

模糊綜合評(píng)價(jià)總分T=Y×K，Y1={0.42 0.27 0.15 0.17}，評(píng)價(jià)等級(jí)K={90，80，70，60}，因此第1個(gè)美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物樣品的模糊綜合評(píng)分為：

同理可得2#—9#美拉德反應(yīng)改良鰻魚骨酶解提取物樣品的模糊綜合感官評(píng)價(jià)總分。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)體系初始pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和木糖添加量4個(gè)因子，設(shè)計(jì)4因數(shù)3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

由表4正交試驗(yàn)極差分析可知，影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)各因素的主次關(guān)系：B反應(yīng)時(shí)間＞C反應(yīng)溫度＞D木糖添加量＞A反應(yīng)體系初始pH值，所以得到美拉德反應(yīng)提取物的最優(yōu)組合為A3B1C2D1，由于此組合不出現(xiàn)在正交試驗(yàn)結(jié)果表4中，所以需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證鰻魚骨酶解液美拉德反應(yīng)提取物工藝條件的穩(wěn)定性，按最佳美拉德反應(yīng)工藝條件A3B1C2D1，分別對(duì)這該組合進(jìn)行3次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該組合的感官評(píng)分（89.25分）明顯優(yōu)于組合A3B1C3D2（85.75分）。所以得到的鰻魚骨酶解液美拉德反應(yīng)提取物最佳組合為A3B1C2D1，即反應(yīng)初始pH值為7.5、反應(yīng)時(shí)間50 min、反應(yīng)溫度120 ℃、木糖添加量1.5%。

2.6 鰻魚酶解液水解度測(cè)定結(jié)果

對(duì)鰻魚骨酶解液水解度進(jìn)行分析測(cè)定，得出試樣中蛋白質(zhì)含量為9.22 g/100g，由此可得鰻魚骨酶解液水解度為7.63%，氨基酸態(tài)氮含量為0.70 g/100mL。

3 結(jié)論

本研究以鰻魚骨為主要原料進(jìn)行蛋白酶水解，在酶解液中加入木糖并通過美拉德反應(yīng)制備出具有鰻魚風(fēng)味的提取物產(chǎn)物，鰻魚骨酶解液美拉德反應(yīng)的工藝經(jīng)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，優(yōu)化后工藝條件為初始pH值7.5、時(shí)間50 min、溫度120 ℃、木糖添加量1.5%，在此優(yōu)化工藝制得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味得到了較大改善，色澤呈棕褐色或棕黃色，烤鰻魚滋味和焦香味濃郁，香氣突出，沒有其他不良異味。