常鑫　楊文曲　韓沖芳　趙雪麗　陳焱

摘要 目的：探討通過(guò)激活Wnt/β－catenin信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)對(duì)七氟醚誘導(dǎo)的老年大鼠術(shù)后認(rèn)知障礙（POCD）的影響。方法：將60只雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、3%七氟醚組（S組）、氯化鋰（LiCl）＋3%七氟醚組（LiCl＋S組），每組20只。S組、LiCl＋S組吸入3%七氟醚6 h，C組吸入空氧混合氣體6 h，LiCl＋S組于吸入七氟醚前連續(xù)5 d腹腔注射LiCl 2 mmol/kg，每日1次。七氟醚麻醉結(jié)束后24 h，隨機(jī)取每組10只大鼠，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)老年大鼠認(rèn)知功能，前4 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即處死大鼠，采用蘇木精－伊紅（HE）染色法觀察海馬組織病理形態(tài)學(xué)改變。七氟醚麻醉結(jié)束后24 h，取每組剩余10只大鼠立即處死，采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）法檢測(cè)海馬區(qū)腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細(xì)胞介素－1（IL－1）、β－catenin及磷酸化糖原合酶激酶 3β（p－GSK－3β）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與C組相比，S組和LiCl＋S組水迷宮實(shí)驗(yàn)第2天、第3天、第4天逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），第5天平臺(tái)所在象限停留時(shí)間明顯縮短（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.05），海馬組織出現(xiàn)病理形態(tài)學(xué)損傷，海馬區(qū)TNF－α及IL－1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），S組海馬區(qū)β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），LiCl＋S組海馬區(qū)β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與S組相比，LiCl＋S組水迷宮第2天、第3天、第4天的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），第5天平臺(tái)所在象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多（P＜0.05），海馬組織病理形態(tài)學(xué)損傷現(xiàn)象有所改善，海馬區(qū)TNF－α及IL－1蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。結(jié)論：LiCl通過(guò)激活Wnt/β－catenin信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)改善七氟醚誘導(dǎo)的術(shù)后認(rèn)知障礙。

關(guān)鍵詞 認(rèn)知障礙；Wnt/β－catenin信號(hào)通路；七氟醚；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.013

術(shù)后認(rèn)知障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是一種多發(fā)于老年人的術(shù)后并發(fā)癥，表現(xiàn)為認(rèn)知能力下降、精神錯(cuò)亂和人格改變等，其發(fā)生影響病人的健康，給病人家庭和社會(huì)造成了極大的負(fù)擔(dān)。因此，預(yù)防POCD的發(fā)生以及促進(jìn)認(rèn)知功能的恢復(fù)具有重要意義［1］。七氟醚是臨床上廣泛應(yīng)用的吸入麻醉藥，研究表明，七氟醚可以誘導(dǎo)老年大鼠發(fā)生認(rèn)知功能損傷，并且與激活的炎癥反應(yīng)有關(guān)［2］。Wnt信號(hào)通路參與對(duì)海馬記憶功能的調(diào)控，包括Wnt3a、糖原合酶激酶 3β（GSK－3β）、β－catenin等，其中GSK－3β是該信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑，氯化鋰（LiCl）是該通路的激活劑［3］。研究證實(shí)，Wnt/β－catenin信號(hào)通路通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF－κB）通路減少炎性因子的轉(zhuǎn)錄，起到抗炎的作用［4］。另外，七氟醚在誘導(dǎo)術(shù)后認(rèn)知障礙過(guò)程中表現(xiàn)出與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）相似的病理改變，而在AD中，LiCl通過(guò)激活Wnt/β－catenin信號(hào)通路可以減輕炎癥反應(yīng)和海馬神經(jīng)元的損傷，起到神經(jīng)保護(hù)的作用［5］。但在七氟醚誘導(dǎo)的POCD中，LiCl是否通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路調(diào)控炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究擬探討LiCl通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路調(diào)控炎癥反應(yīng)在七氟醚誘導(dǎo)POCD中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

60只300～350 g雄性SD大鼠（鼠齡19～22個(gè)月）由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)前在暗室［溫度（23±3）℃，相對(duì)濕度40%～70%］分籠飼養(yǎng)1周，并給予充足的水與食物。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、3%七氟醚組（S組）、LiCl＋3%七氟醚組（LiCl＋S組），每組20只。參考相關(guān)文獻(xiàn)［6］的方法，S組、LiCl＋S組吸入3%七氟醚6 h，C組吸入空氧混合氣體6 h。LiCl＋S組于吸入七氟醚前連續(xù)5 d腹腔注射LiCl（120M0215V，Sigma公司）2 mmol/kg，每日1次。

1.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

每組隨機(jī)取10只大鼠在麻醉結(jié)束后24 h行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，前4 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。前4 d將大鼠依次從不同象限面向池壁放入水中，記錄大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避潛伏期，停留30 s后進(jìn)行下一象限的實(shí)驗(yàn)。將60 s內(nèi)未找到平臺(tái)的逃避潛伏期記為60 s，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)并停留30 s。第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將水中平臺(tái)撤除，并將大鼠從任一象限放入水中。記錄其在60 s內(nèi)的游泳速度、穿越平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)所在象限停留時(shí)間。

1.3 蘇木精－伊紅（HE）染色

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在冰上取出大鼠腦組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后在4%多聚甲醛中固定，然后進(jìn)行脫水，石蠟包埋，切片。將石蠟切片進(jìn)行HE染色，中性樹脂封片，然后在顯微鏡下觀察。

1.4 蛋白免疫印跡法（Western? Blot）檢測(cè)

每組取剩余10只大鼠在麻醉后的24 h立即處死，取出海馬組織，提取目標(biāo)蛋白，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）方法，將準(zhǔn)備好的樣品液和預(yù)染蛋白Marker分別上樣，電泳分離蛋白。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后在5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h。加入腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細(xì)胞介素－1（IL－1）、β－catenin、磷酸化GSK－3β（p－GSK－3β）及甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（1∶1 000，武漢愛博泰克生物科技有限公司）4 ℃過(guò)夜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000，武漢愛博泰克生物科技有限公司），室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法對(duì)條帶顯影后，采用Image J軟件檢測(cè)海馬區(qū)TNF－α、IL－1、β－catenin及p－GSK－3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間差異的采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠認(rèn)知功能比較

3組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)第1天逃避潛伏期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第2天、第3天、第4天逃避潛伏期逐漸縮短。與C組比較，S組和LiCl＋S組水迷宮實(shí)驗(yàn)第2天、第3天、第4天逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，第5天平臺(tái)所在象限停留時(shí)間明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與S組比較，LiCl＋S組水迷宮實(shí)驗(yàn)第2天、第3天、第4天的逃避潛伏期明顯縮短，第5天平臺(tái)所在象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)期間游泳速度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1、表2。

2.2 3組大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)比較

C組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞排列整齊規(guī)則。與C組比較，S組海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞分布不均勻，排列紊亂，出現(xiàn)大量核固縮。與S組比較，LiCl＋S組海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂現(xiàn)象有所改善，出現(xiàn)核固縮的細(xì)胞減少。詳見圖1。

2.3 3組大鼠海馬區(qū)TNF－α、IL－1、β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達(dá)水平比較

與C組比較，S組海馬區(qū)TNF－α及IL－1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；LiCl＋S組海馬區(qū)TNF－α及IL－1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與S組比較，LiCl＋S組海馬區(qū)TNF－α及IL－1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。詳見表3、圖2。

3 討 論

七氟醚可以誘導(dǎo)POCD的發(fā)生，導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力的下降［7］。以往研究表明，當(dāng)吸入高于3%濃度的七氟醚6 h后，老年大鼠認(rèn)知功能發(fā)生明顯損傷［8］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇吸入3%七氟醚6 h。與C組相比，S組大鼠在七氟醚麻醉后的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，平臺(tái)所在象限停留時(shí)間明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少。說(shuō)明七氟醚麻醉后大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知能力的下降，模型制作成功。

麻醉后機(jī)體釋放的大量細(xì)胞信號(hào)分子結(jié)合相應(yīng)受體而觸發(fā)炎癥反應(yīng)，包括TNF－α、IL－1、IL－6等［9］。海馬區(qū)TNF－α、IL－6等炎性因子的異常表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與POCD的發(fā)生［10］。七氟醚通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致POCD的發(fā)生［11］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，吸入七氟醚超過(guò)3 h可以促進(jìn)POCD的發(fā)生，并且與血清TNF－α的表達(dá)水平有關(guān)［12］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在七氟醚誘導(dǎo)的老年大鼠POCD模型中，海馬組織神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生了明顯損傷［8］。本研究結(jié)果顯示，老年大鼠吸入3%七氟醚6 h后認(rèn)知能力下降，海馬區(qū)中TNF－α及IL－1表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)光學(xué)顯微鏡下海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞分布不均勻，排列紊亂。證實(shí)了七氟醚誘導(dǎo)的POCD與激活的炎癥反應(yīng)有關(guān)，與以往的研究結(jié)果相符。

Wnt/β－catenin通路的激活可抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，一方面，Wnt共受體LRP5包含一種抗炎巨噬細(xì)胞表型，可以減少單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化［13］；另一方面，Wnt/β－catenin通過(guò)磷酸化GSK－3β抑制核因子－κB（NF－κB）信號(hào)通路，從而減少促炎基因的轉(zhuǎn)錄［14］。研究證實(shí)，Wnt/β－catenin通路參與了POCD的發(fā)生［15］，在內(nèi)皮細(xì)胞中，吸入3%七氟醚6 h可以抑制Wnt/β－catenin通路，從而下調(diào)Annexin A1的表達(dá)，引起血腦屏障的損傷，導(dǎo)致POCD的發(fā)生［16］。轉(zhuǎn)基因小鼠中，DKK－1的過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制Wnt/β－catenin通路，引起Tau蛋白過(guò)度磷酸化和認(rèn)知功能障礙［17］。在本研究中，LiCl＋S組大鼠吸入3%七氟醚6 h后，海馬區(qū)β－catenin及p－GSK－3β表達(dá)水平下降，TNF－α及IL－1表達(dá)水平升高，同時(shí)海馬形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷。提示七氟醚麻醉后海馬區(qū)GSK－3β活性升高，抑制Wnt/β－catenin信號(hào)通路活性，從而炎癥反應(yīng)被激活。LiCl是Wnt/β－catenin通路的激活劑，可以調(diào)節(jié)GSK－3β的活性［18］，給予LiCl干預(yù)后，與S組比較，老年大鼠海馬區(qū)β－catenin及p－GSK－3β表達(dá)水平升高，TNF－α及IL－1表達(dá)水平明顯下降，同時(shí)海馬形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)損傷減輕，學(xué)習(xí)和記憶能力有所改善。表明Wnt/β－catenin通路參與了七氟醚誘導(dǎo)POCD的發(fā)生，LiCl通過(guò)激活Wnt/β－catenin通路，減少炎性因子的表達(dá)和減輕海馬組織的損傷，改善老年大鼠的術(shù)后認(rèn)知功能。

綜上所述，七氟醚通過(guò)抑制Wnt/β－catenin通路，激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致海馬組織損傷和POCD的發(fā)生。外源性Wnt/β－catenin激活劑LiCl可以明顯上調(diào)Wnt/β－catenin通路，抑制炎癥反應(yīng)，減輕海馬組織病理形態(tài)學(xué)損傷，改善認(rèn)知功能。

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（收稿日期：2022－01－08）

（本文編輯郭懷印）

通訊作者 韓沖芳，E－mail：hanchongfang2003@foxmail.com

引用信息 常鑫，楊文曲，韓沖芳，等.Wnt/β－catenin信號(hào)通路在七氟醚誘導(dǎo)術(shù)后認(rèn)知障礙中的作用機(jī)制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（1）：75－78.