胡悅,劉娜,秦禮康*,包愛(ài)明,秦偉軍,梁小央

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽(yáng),550000)2(貴州南山婆食品加工有限公司,貴州 安順,561000)

紅酸湯屬于蔬菜類發(fā)酵食品[1],主要以辣椒和番茄為原料發(fā)酵制成,因色澤誘人、酸辣適口以及富含多種營(yíng)養(yǎng)功能成分,成為貴州省內(nèi)苗族、侗族的一種特色傳統(tǒng)美食。但傳統(tǒng)紅酸湯發(fā)酵周期1個(gè)月到12個(gè)月不等,容易引起微生物菌群波動(dòng),導(dǎo)致發(fā)酵紅酸湯風(fēng)味及品質(zhì)不穩(wěn)定,這已成為制約紅酸湯發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。民間常見(jiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵工藝是由紅辣椒和番茄分別輔以糯米飯、食鹽、大蒜等發(fā)酵制成“番茄酸湯”和“辣椒酸湯”半成品,再按1∶1比例混合進(jìn)行二次發(fā)酵制成紅酸湯[2],即分料發(fā)酵工藝。另一種是直接將番茄、辣椒、糯米、食鹽等混合發(fā)酵,即混料發(fā)酵工藝。值得注意的是,分料發(fā)酵工藝是通過(guò)番茄酸湯和辣椒酸湯分料發(fā)酵后再將二者混合發(fā)酵,更多的、復(fù)雜的微生物群落物種在適宜環(huán)境下相互作用后發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸、氨基酸等風(fēng)味成分,從而最大限度保持或增加紅酸湯的風(fēng)味品質(zhì)。

發(fā)酵紅酸湯因其不同的發(fā)酵環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng),導(dǎo)致微生物菌群結(jié)構(gòu)不同,但乳桿菌科(Lactobacillaceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)作為共性優(yōu)勢(shì)菌,在紅酸湯發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用。何揚(yáng)波等[3]表明納木雷氏乳桿菌(Lactobacillusnamurensis)和戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)分別為辣椒酸湯和番茄酸湯的優(yōu)勢(shì)乳酸菌,漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和膜璞畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)分別為兩種酸湯發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)真菌。LIN等[4]發(fā)現(xiàn)德凱拉菌屬(Dekkera)和畢赤酵母屬(Pichia)是番茄酸湯中的主要優(yōu)勢(shì)菌,酵母菌屬和畢赤酵母屬是辣椒酸湯中的主要真菌,畢赤酵母屬是另一種番茄酸湯中的主要真菌。王琪琪等[5]發(fā)現(xiàn)辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus),辣椒紅酸湯的優(yōu)勢(shì)真菌為Kazachstania、酵母屬、雙足囊菌屬(Dipodascus)、畢赤酵母屬,番茄紅酸湯的優(yōu)勢(shì)真菌為Kazachstania、畢赤酵母屬。宮路路等[6]發(fā)現(xiàn)凱里紅酸湯3個(gè)樣品細(xì)菌群落多樣性各有差異,ST9和ST10樣品優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌屬,ST22樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、Aeribacillus等。

除高通量測(cè)序外,研究者還用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法,對(duì)微生物優(yōu)勢(shì)功能微生物進(jìn)行篩選、分離、鑒定。田永峰[7]在苗酸湯中篩選出了pH下降快、產(chǎn)酸率高的嗜酸乳桿菌,但并未對(duì)菌株產(chǎn)酸量進(jìn)行研究。張玉龍等[8]從紅酸湯篩選出產(chǎn)胞外多糖和抗氧化能力的葡萄球菌H1(StaphylococcusH1),但未對(duì)其產(chǎn)酸能力進(jìn)行研究。鄭莎莎等[9]采用紅酸湯中優(yōu)勢(shì)菌干酪乳桿菌H1(LactobacilluscaseiH1)和鼠李糖乳桿菌H3(LactobacillusrhamnosusH3)強(qiáng)化發(fā)酵紅酸湯,但未見(jiàn)菌種特性的報(bào)道。XIONG等[10]從凱里紅酸湯中篩選出優(yōu)勢(shì)菌種布氏乳桿菌H9(LactobacillusbuchneriH9),產(chǎn)酸能力為(3.268±0.016) g/L。賀曉潔等[11]從傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒酸湯中篩選出1株耐鹽植物乳桿菌L-14(LactobacillusplantarumL-14),并測(cè)得產(chǎn)酸量為(7.770±0.033) g/L。上述研究中僅對(duì)紅酸湯及其半成品的微生物進(jìn)行了優(yōu)勢(shì)菌種的篩選,局限于紅酸湯微生物區(qū)系的探討和菌株的產(chǎn)酸性能研究,對(duì)酸湯中菌株的益生特性研究較少。近年來(lái),具備胃腸道耐受性和抗氧化能力的菌株備受關(guān)注,相關(guān)研究大多集中在泡菜和乳品中乳酸桿菌的耐酸、耐膽鹽和抗氧化性能[12-14]方面,而鮮有關(guān)于紅酸湯中功能益酵菌株的相關(guān)報(bào)道。

本研究分別以分料發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)番茄酸湯、辣椒酸湯和混合酸湯為菌源,分離篩選并鑒定出益酵乳酸菌和酵母菌,并研究其應(yīng)用特性,初步構(gòu)建一種可應(yīng)用于紅酸湯強(qiáng)化發(fā)酵模式的級(jí)聯(lián)發(fā)酵體系,為人工接種乳酸菌和酵母菌強(qiáng)化發(fā)酵紅酸湯提供理論應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品:貴州南山婆食品加工有限公司2020年下半年所產(chǎn)分料發(fā)酵紅酸湯的3個(gè)組成部分,分別是TA1、TA2和TA3(番茄酸湯),CA1和CA2(辣椒酸湯),MA1和MA2(混合酸湯),均于2021年11月采集,4 ℃條件下運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。

材料與試劑:牛膽鹽、美藍(lán)染液、革蘭氏染色試劑套盒、抗氧化能力檢測(cè)試劑盒[羥自由基(·OH)、DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力],北京索萊寶科技有限公司;MRS、PDA、YPD瓊脂培養(yǎng)基和MRS、PDB、YEPD液體培養(yǎng)基,上海博微生物科技有限公司;NaCl、H2O2、NaOH、丙三醇、濃鹽酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DMEX20電子顯微鏡,寧波舜宇儀器有限公司;SW-CJ-2D0雙人凈化工作臺(tái),浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司;HH-B11600BY電熱恒溫生化培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;Spectra Max 190光吸收酶標(biāo)儀,美谷分子有限公司;ZWY-C2112B恒溫?fù)u床,上海智城分析儀器制造有限公司;L5S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;LDZF-75KB-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 采樣

取樣品封存至無(wú)菌采樣瓶中,分別是TA1、TA2和TA3(番茄酸湯),CA1和CA2(辣椒酸湯),MA1和MA2(混合酸湯),均以4 ℃保存運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 乳酸菌和酵母菌的分離純化

將樣品用無(wú)菌生理鹽水稀釋至合適的濃度梯度,分別涂布在MRS瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,在PDA瓊脂培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3～5 d,分別挑出疑似乳酸菌和酵母菌的菌落,用平板劃線法進(jìn)一步純化,重復(fù)純化4～5次,直到獲得單個(gè)菌落。分別將純化的單個(gè)菌落保存在4 ℃的MRS斜面培養(yǎng)基和YPD斜面培養(yǎng)基中直至使用,每4周進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)。

1.3.3 菌株形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)

將在MRS瓊脂培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)得到的疑似乳酸菌的菌落固定到干凈的載玻片上,進(jìn)行革蘭氏染色,置于顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)并拍照記錄,紫色和紅色分別代表革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性。同時(shí)進(jìn)行過(guò)氧化氫酶測(cè)試,在超凈工作臺(tái)用接種環(huán)挑取菌落于干凈的載玻片上,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3% H2O2溶液,30 s內(nèi)出現(xiàn)氣泡為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性,反之為陰性。將過(guò)氧化氫酶陰性和革蘭氏陽(yáng)性的菌株暫視為乳酸菌。將在PDA瓊脂培養(yǎng)基上得到的疑似酵母菌的菌落固定到干凈的載玻片上,用美藍(lán)染液染色后于顯微鏡下觀察真菌形態(tài)并拍照記錄,具有典型酵母特征的菌株暫視為酵母菌。通過(guò)菌株形態(tài)和生理生化特征篩選暫視為乳酸菌和酵母菌的菌株保存在4 ℃斜面培養(yǎng)基和-80 ℃凍存管中。

1.3.4 益酵菌株的篩選和功能特性

1.3.4.1 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力的測(cè)定

參考LIU等[15]的方法按照3%接種量將活化的乳酸菌種子液分別接種到pH 2.0和pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中,含0.3 g/L和0.6 g/L牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)16 h后測(cè)定菌株的OD600nm。

1.3.4.2 乳酸菌和酵母菌產(chǎn)酸能力的測(cè)定

根據(jù)ZHENG等[16]的方法稍作修改,吸取10.0 mL菌液于100 mL容量瓶中,加水至刻度,混勻。吸取20.0 mL,置于200 mL燒杯中,加60 mL水,開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器,用NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至酸度計(jì)指示pH 8.2,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.4.3 產(chǎn)香酵母的篩選

將活化的酵母菌種子液在恒溫?fù)u床(30 ℃,120 r/min)中培養(yǎng)1 d,參考文獻(xiàn)[17-20]用感官嗅聞法篩選產(chǎn)香酵母并稍作修改,請(qǐng)10位食品專業(yè)品評(píng)人員將樣品置于鼻孔下方,嗅聞?chuàng)]發(fā)的香氣,進(jìn)行香氣評(píng)價(jià),主要內(nèi)容如表1所示,主要包括勾選香氣類型和香氣濃淡、選填香氣描述,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以票數(shù)過(guò)半(n≥5)的香氣評(píng)價(jià)為準(zhǔn),以此篩選有較濃酯香或特殊果香的酵母菌株。

表1 香氣評(píng)價(jià)表Table 1 Aroma evaluation form

1.3.4.4 乳酸菌和酵母菌抗氧化性能的測(cè)定

將所篩選出的菌株種子液用·OH清除能力檢測(cè)試劑盒、DPPH自由基清除能力檢測(cè)試劑盒和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力檢測(cè)試劑盒測(cè)定菌株相應(yīng)抗氧化能力,按照試劑盒的說(shuō)明操作和計(jì)算。

1.3.5 菌種鑒定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

分別按Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒和Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取基因組,用細(xì)菌通用引物27 F和1492 R擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA序列,用酵母通用引物NL1和NL4擴(kuò)增酵母的26S rDNA D1/D2區(qū)序列,PCR產(chǎn)物測(cè)序后在核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST對(duì)比。設(shè)置Bootstrap method重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000,Gaps/Missing Data Treatment 采用Pairwise deletion模型。在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析,用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)(multiple alignments),并用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng),采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.6 級(jí)聯(lián)發(fā)酵模式菌株生長(zhǎng)初探

參考張東亞[2]和韋明明[21]的紅酸湯制作方法稍作修改。無(wú)損傷的本地新鮮番茄洗凈破碎備用,添加6%食鹽,2%糯米飯,3%菌株lt1-6的二代種子液,30 ℃發(fā)酵制得番茄酸湯,發(fā)酵96 h期間每12 h涂布1次計(jì)算乳酸菌活菌數(shù)并測(cè)番茄酸湯的pH值;無(wú)損傷的新鮮紅美人辣椒、姜、大蒜洗凈破碎備用,添加7%食鹽,3%姜,2%大蒜、4%糯米飯和3%菌株lc2-1的二代種子液,30 ℃發(fā)酵制得辣椒酸湯,發(fā)酵96 h期間每12 h涂布1次計(jì)算乳酸菌活菌數(shù)并測(cè)辣椒酸湯的pH值;將發(fā)酵了96 h的番茄酸湯和辣椒酸湯按照1∶1的比例混合均勻,添加5%菌株ym1-3的二代種子液,30 ℃發(fā)酵制得混合酸湯繼續(xù)發(fā)酵,發(fā)酵96 h期間每12 h涂布1次計(jì)算酵母菌活菌數(shù)并測(cè)混合酸湯的pH值。參照何揚(yáng)波等[3]用酸度計(jì)測(cè)量樣品pH值;乳酸菌和酵母菌計(jì)數(shù)分別參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》和GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

從圖1乳酸菌的菌落形態(tài)和顯微鏡下的菌株微觀結(jié)構(gòu)可以看到不同乳酸菌呈現(xiàn)出球形、短棒狀、中棒狀、長(zhǎng)棒狀和橢圓形等形態(tài),初步篩選出43株乳酸菌。從圖2酵母菌的菌落形態(tài)和顯微鏡下的菌株微觀結(jié)構(gòu)可以看到不同酵母菌呈現(xiàn)出了變色、淡黃色等菌落形態(tài);顯微鏡下呈現(xiàn)出球形、米粒狀等形態(tài),初步篩選出28株酵母菌。

圖1 乳酸菌菌落形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Colony morphology and microstructure of lactic acid bacteria

圖2 酵母菌菌落形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)Fig.2 Colony morphology and microstructure of yeast

2.2 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力分析

通過(guò)微生物傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法分離純化樣品中的可培養(yǎng)微生物,結(jié)合本課題組前期研究的高通量測(cè)序結(jié)果,主要篩選紅酸湯中的乳酸菌和酵母菌。通過(guò)菌落形態(tài)、顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)、生理生化特征等,篩選出了26株乳酸菌進(jìn)行pH 3.0和2.0下的耐酸能力和膽鹽質(zhì)量濃度0.3、0.6 g/L下的耐膽鹽能力測(cè)定。食物經(jīng)胃液消化,pH值通常為3.0左右,隨后與腸道內(nèi)的膽鹽接觸,膽鹽能破壞細(xì)胞膜完整度造成細(xì)胞死亡,因此耐酸耐膽鹽能力是衡量菌株益生特性的重要指標(biāo)[22]。從表2可以看出菌株在pH 3.0下的耐酸能力要高于pH 2.0下的耐酸能力,在0.3 g/L膽鹽濃度下菌種的生長(zhǎng)能力要高于0.6 g/L膽鹽濃度的菌種生長(zhǎng)能力。考慮到從紅酸湯不同組成成分中(番茄酸湯、辣椒酸湯和混合酸湯)分別選出益酵菌株,并且耐酸耐膽鹽能力均需較好的條件下,選擇了的10株優(yōu)良的乳酸菌(lt1-2、lt1-3、lt1-4、lt1-6、lt1-7、lt3-5、lc2-1、lm1-4、lm2-1和ly-3)進(jìn)行產(chǎn)酸能力測(cè)定。

表2 乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力(OD600nm)Table 2 Acid and bile salt tolerance of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌和酵母菌產(chǎn)酸能力分析

將10株乳酸菌與通過(guò)微生物傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法分離純化,菌落形態(tài)、顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)、生理生化特征等篩選出的10株酵母菌進(jìn)行產(chǎn)酸能力測(cè)定,從表3可以發(fā)現(xiàn)番茄酸湯中l(wèi)t1-3、lt1-6、lt3-5產(chǎn)酸能力較好,且目前未見(jiàn)對(duì)番茄酸湯的菌株產(chǎn)酸能力的研究報(bào)道。辣椒酸湯中l(wèi)c2-1產(chǎn)酸能力較好,產(chǎn)酸能力[(7.92±0.01) g/kg]優(yōu)于賀曉潔等[11]從傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒酸湯中篩選出1株耐鹽植物乳桿菌L-14產(chǎn)酸能力[(7.770±0.033) g/L]。發(fā)酵紅酸湯中l(wèi)m2-1產(chǎn)酸能力較好,為(8.69±0.03) g/kg,優(yōu)于XIONG等[10]從凱里紅酸湯中篩選出優(yōu)勢(shì)菌種布氏乳桿菌H9的產(chǎn)酸能力[(3.268±0.016) g/L]。另外,酵母菌的產(chǎn)酸能力都弱于乳酸菌。將此結(jié)果與耐酸耐膽鹽能力相結(jié)合,篩選出了6株乳酸菌進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定,10株酵母菌繼續(xù)進(jìn)行產(chǎn)香特性分析。

表3 乳酸菌、酵母菌的產(chǎn)酸能力Table 3 Acid production capacity of lactic acid bacteria and yeast

2.4 酵母菌的產(chǎn)香能力

根據(jù)消費(fèi)者感官偏好的重要性,香氣濃郁、醇香味和鮮味是重要的香氣評(píng)價(jià)指標(biāo)[23]。通過(guò)感官嗅聞法評(píng)價(jià)酵母菌種子液的香氣特征,大多數(shù)能產(chǎn)酯香、醇香。表4為10株酵母菌的香氣評(píng)價(jià)表,據(jù)此選出7株較優(yōu)秀的酵母菌(yt1-1、ym1-1、ym1-3、ym1-6、ym1-7、ym2-1和yy-2)進(jìn)行抗氧化能力的測(cè)定,尤其是ym1-3,能產(chǎn)水果香,香氣濃郁且細(xì)膩清新,產(chǎn)香能力較好,目前未有關(guān)于紅酸湯及其半成品產(chǎn)香能力菌株的報(bào)道。

表4 酵母菌的香氣評(píng)價(jià)Table 4 Aroma evaluation of yeast

2.5 乳酸菌和酵母菌抗氧化性能分析

由表5和表6可知,菌株的DPPH自由基清除能力較·OH清除能力和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力較好。綜合考慮耐酸耐膽鹽、產(chǎn)酸、產(chǎn)香和抗氧化能力后,從番茄酸湯中選擇了lt1-6,辣椒酸湯中選擇了lc2-1,混合酸湯中選擇了ym1-3作為強(qiáng)化發(fā)酵菌株。目前對(duì)于紅酸湯功能菌種的報(bào)道研究較少,僅有張玉龍等[8]從紅酸湯篩選出的產(chǎn)胞外多糖和抗氧化能力的葡萄球菌H1,但未研究其產(chǎn)酸能力。

表5 乳酸菌的抗氧化能力 單位:%

表6 酵母菌的抗氧化能力 單位:%

2.6 菌種鑒定結(jié)果

通過(guò)16S rRNA 和26S rRNA序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定這3株性能優(yōu)良的菌種lt1-6、lc2-1和ym1-3分別為L(zhǎng)entilactobacillusbuchneri、Pediococcusethanolidurans和Kazachstaniabulderi(圖3、圖4)。對(duì)紅酸湯中L.buchneri的研究,僅有XIONG等[10]從凱里紅酸湯中篩選出優(yōu)勢(shì)菌種布氏乳桿菌H9,產(chǎn)酸能力為(3.268±0.016) g/L。劉玉凌等[24]從傳統(tǒng)榨菜中分離出的一株發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌ZH2為Kazachstaniabulderi,不產(chǎn)膜,產(chǎn)氣、產(chǎn)醇能力強(qiáng),且能耐受較低pH值和較高鹽濃度(10%)。但目前未見(jiàn)P.ethanolidurans和K.bulderi的相關(guān)紅酸湯篩菌報(bào)道。

a-lt1-6系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);b-lc2-1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4 基于26S rRNA序列的同源性繪制的ym1-3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of ym1-3 based on homology of 26S rRNA sequences

2.7 菌株生長(zhǎng)曲線

研究菌種生長(zhǎng)是否適合于食品發(fā)酵體系具有十分重要的意義[25]。對(duì)3株菌種的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了研究,結(jié)果如圖5,lt1-6在6 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,OD600nm值為0.140,pH值為5.78;菌株lc2-1則需要16 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,pH值為5.78左右;菌株ym1-3在6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期,OD600nm值為0.160,pH值為5.48。本部分研究可為后續(xù)在特定時(shí)間進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵接種紅酸湯提供數(shù)據(jù)參考。

a-lt1-6生長(zhǎng)曲線;b-lc2-1生長(zhǎng)曲線;c-ym1-3生長(zhǎng)曲線

2.8 級(jí)聯(lián)發(fā)酵模式菌株生長(zhǎng)情況

從圖6可知,lt1-6接種至番茄酸湯后,0～36 h生長(zhǎng)緩慢,pH值降低幅度較慢;36～96 h時(shí)生長(zhǎng)快速,pH值從4.0下降到3.5;在96 h時(shí)菌濃度為(4.925±0.020)×107CFU/mL,pH值為3.51±0.02,此時(shí)微生物已適應(yīng)環(huán)境,且能最大程度地發(fā)揮其生物學(xué)功能,與韋明明[21]的結(jié)論相同,即乳酸菌在番茄酸湯中能夠良好生長(zhǎng)。lc2-1接種至辣椒酸湯后,12～72 h pH值下降較快;72～96 h pH值下降較為緩慢,活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的變化,84 h達(dá)到生長(zhǎng)最高點(diǎn),菌濃度為(10.000±0.000)×107CFU/mL,pH值為3.41±0.01;在96 h時(shí)菌濃度為(5.900±0.020)×107CFU/mL,pH值為3.32±0.02,菌落總數(shù)稍有回落,可能是發(fā)酵后期基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)有限而限制微生物生長(zhǎng)[26]。番茄酸湯與辣椒酸湯發(fā)酵96 h后二者1∶1混合,接種ym1-3,菌株生長(zhǎng)情況良好,pH值在接種12 h下降后基本穩(wěn)定在3.29。結(jié)果表明這3株菌種分別在發(fā)酵底物中生長(zhǎng)情況良好,且加速酸湯成熟,可考慮作為紅酸湯級(jí)聯(lián)發(fā)酵體系的強(qiáng)化發(fā)酵菌株進(jìn)行研究并應(yīng)用于生產(chǎn)。

a-番茄酸湯接種lt1-6生長(zhǎng)情況;b-辣椒酸湯接種lc2-1生長(zhǎng)情況;c-混合酸湯接種ym1-3生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論

本研究從紅酸湯半成品番茄酸湯中篩選出一株產(chǎn)酸功能菌種為lt1-6[產(chǎn)酸能力(7.41±0.02) g/kg,·OH清除能力(0.15±0.00)%,DPPH自由基清除能力(30.38±0.00)%,ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力(6.73±0.03)%],辣椒酸湯中篩選出一株產(chǎn)酸功能菌種為lc2-1[產(chǎn)酸能力(7.92±0.01) g/kg,·OH清除能力(2.05±0.02)%,DPPH自由基清除能力(34.65±0.01)%,ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力(4.82±0.04)%],二次發(fā)酵混合酸湯中篩選出一株產(chǎn)香功能菌種為ym1-3[可產(chǎn)濃郁水果香,·OH清除能力(5.75±0.02)%,DPPH自由基清除能力(30.90±0.02)%,ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力(0.53±0.03)%],通過(guò)分子生物學(xué)鑒定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定這3株性能優(yōu)良的菌種分別為L(zhǎng).buchneri、P.ethanolidurans和K.bulderi,通過(guò)級(jí)聯(lián)發(fā)酵體系(用L.buchneri和P.ethanolidurans分別發(fā)酵96 h后的番茄酸湯和辣椒酸湯按1∶1復(fù)配再接種K.bulderi發(fā)酵96 h)驗(yàn)證,菌株生長(zhǎng)情況良好,番茄酸湯中L.buchneri濃度為(4.925±0.020)×107CFU/mL,辣椒酸湯中P.ethanolidurans濃度為(5.900±0.021)×107CFU/mL,混合酸湯中K.bulderi濃度為(0.150±0.031)×107CFU/mL,發(fā)酵酸度高(pH值均小于3.51±0.02),初步構(gòu)建一種可應(yīng)用于紅酸湯強(qiáng)化發(fā)酵模式的級(jí)聯(lián)發(fā)酵體系,將為人工接種乳酸菌和酵母菌強(qiáng)化發(fā)酵紅酸湯提供技術(shù)參考。