趙子剛,金明義,劉露,張葵

(北大醫(yī)藥重慶大新藥業(yè)股份有限公司,重慶,400714)

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)是目前已知催化效率最高的氧化還原輔酶[1],最早在細菌細胞中發(fā)現(xiàn)[2],隨后的研究表明其在哺乳動物體內(nèi)起到很重要的作用[3-4],日本的研究者認為PQQ符合維生素的特征,主張將其列為一種新的B族維生素[5]。目前的研究發(fā)現(xiàn),PQQ具有促進細胞增殖[6]、促進神經(jīng)生長因子合成[7]、抗氧化作用[8-9]、保護大腦[10]、保護心臟[11]、保護肝臟[12-13]、抑制淀粉樣蛋白原纖化[14]等多種生理功能。目前的研究還沒有發(fā)現(xiàn)動物和人類能夠自身合成PQQ,可以認為動物和人類體內(nèi)的PQQ都來源于細菌,但是動物和人類的腸道細菌不能合成PQQ或者合成量極少,無法滿足自身需要,因此,動物和人類都需要從食物中攝取PQQ。因其具有多種積極的生理作用,PQQ已被美國FDA和歐盟食品安全局批準(zhǔn)為一種安全的膳食補充劑[15],具有良好的開發(fā)前景。

PQQ的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法,其中,化學(xué)合成法是早期使用的生產(chǎn)方法,因其反應(yīng)步驟多,生產(chǎn)成本高,現(xiàn)在已被淘汰。目前PQQ的生產(chǎn)方法主要是微生物發(fā)酵法,能大量合成PQQ的微生物主要有甲基桿菌屬(Methylobacterium)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、食甲基菌(Methylovorus)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)等。而發(fā)酵工業(yè)上應(yīng)用較多的是以生絲微菌屬(Hyphomicrobium)作為生產(chǎn)菌種,以甲醇作為發(fā)酵碳源,以補料分批發(fā)酵法作為常用的發(fā)酵方法[16-17]。有學(xué)者通過發(fā)酵動力學(xué)的研究表明,生絲微菌發(fā)酵產(chǎn)PQQ屬于生長部分偶聯(lián)型發(fā)酵,較長的穩(wěn)定期有利于提高PQQ的產(chǎn)量;生絲微菌分批培養(yǎng)過程的甲醇消耗動力學(xué)模型表明,甲醇大部分用于菌體生長,少部分用于PQQ合成,極少部分用于維持菌體的自身代謝需求,致使菌體生長穩(wěn)定期很短,PQQ產(chǎn)量較低,分批補料培養(yǎng)過程中應(yīng)該控制菌體的生長速率[18]。

因為生絲微菌發(fā)酵產(chǎn)PQQ屬于生長部分偶聯(lián)型發(fā)酵,PQQ的生物合成都會伴隨著菌體生長,菌體生長由少到多是一個連續(xù)不斷的過程,菌體濃度會不斷增加,因此PQQ補料分批發(fā)酵法穩(wěn)定期較短,制約了PQQ發(fā)酵產(chǎn)量的進一步提高。根據(jù)生絲微菌生長部分偶聯(lián)型發(fā)酵產(chǎn)PQQ的特點,可以考慮用連續(xù)發(fā)酵的方法來提高其發(fā)酵產(chǎn)量,趙子剛等[19]開創(chuàng)性的使用了半連續(xù)發(fā)酵的方法生產(chǎn)PQQ,維持菌體濃度在合適的范圍,延長了穩(wěn)定期,提高了PQQ發(fā)酵產(chǎn)量。本文將進一步研究采用單級連續(xù)發(fā)酵法生產(chǎn)PQQ的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

生絲微菌(Hyphomicrobiumsp.)DSM1869,北大醫(yī)藥重慶大新藥業(yè)股份有限公司保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基配方

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配方:(NH4)2SO43.0 g/L,NaH2PO4·12H2O 3.0 g/L,K2HPO41.4 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,CaCl2·2H2O 21 mg/L,ZnSO4·7H2O 15.75 mg/L,FeSO4·7H2O 5.25 mg/L,MnSO4·4H2O 3.15 mg/L,CuSO4·5H2O 0.525 mg/L,NaCl 1.05 mg/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 21 μg/L,KI 21 μg/L,CoCl2·6H2O 21 μg/L,H3BO321 μg/L。

斜面培養(yǎng)基配方:在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配方中添加20 g/L的瓊脂,配制好后滅菌,冷卻到60 ℃左右,再加入20 mL/L的甲醇搖勻,擺成斜面冷卻待用。

種子培養(yǎng)基配方:將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后添加10 mL/L的甲醇即為種子培養(yǎng)基。

1.3 儀器與設(shè)備

GUJS-5型發(fā)酵罐、GUJS-50型發(fā)酵罐,鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司;UV2400型紫外可見分光光度計,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;SBA-40D型生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所;LC-2010CHT型高效液相色譜儀,島津公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

將保藏的生絲微菌菌種接種于斜面培養(yǎng)基,在29～31 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)144～192 d;從斜面接種到種子瓶,種子瓶在29～31 ℃、250 r/min的搖床上培養(yǎng)40～48 h;將種子瓶中的種子液按照1%的比例接種到5 L種子罐中,種子罐裝量為3 L,種子罐的培養(yǎng)條件:罐溫29～31 ℃,通氣量3 L/min,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min,培養(yǎng)周期40～48 h。

1.4.2 補料分批發(fā)酵培養(yǎng)

將種子罐中的種子液按照10%的比例接種到50 L發(fā)酵罐中,發(fā)酵罐初始裝量為30 L,補料分批發(fā)酵的培養(yǎng)條件:罐溫29～31 ℃,通氣量1 200～1 800 L/h,攪拌轉(zhuǎn)速100～600 r/min,通過調(diào)整通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速控制發(fā)酵液中的溶氧值在30%以上,通過補氨水控制發(fā)酵液的pH值在6.8～7.0,發(fā)酵周期264 h。補料分批發(fā)酵的補甲醇工藝:發(fā)酵罐接種后就開始用蠕動泵連續(xù)補料甲醇,每隔8 h取樣用生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中的甲醇含量,根據(jù)測得的甲醇含量調(diào)整蠕動泵的補料速度,將發(fā)酵液中的甲醇質(zhì)量濃度控制在0.1～1.0 g/L。

1.4.3 單級連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)

在補料分批發(fā)酵進行到一定階段時,轉(zhuǎn)到單級連續(xù)發(fā)酵,用蠕動泵以一定的速率分別補入甲醇、氨水和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,同時用蠕動泵以一定的速率從罐底部的放料閥門連續(xù)放料,收集放料的發(fā)酵液送去提取工序。調(diào)整各補料和放料的速率,保持發(fā)酵罐體積不變,即實現(xiàn)單級連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。

1.5 分析方法

1.5.1 發(fā)酵液中菌體濃度的檢測

因為PQQ的發(fā)酵培養(yǎng)基由甲醇、可溶性的無機鹽和微量維生素組成,無色透明,另外PQQ的發(fā)酵菌種生絲微菌為球狀細菌,所以檢測發(fā)酵液在一定波長下的光密度值即可代表發(fā)酵液中的菌體濃度。如有必要將發(fā)酵液樣品適當(dāng)稀釋,以純水作為對照,用分光光度計測定其在波長600 nm下的光密度值(OD600)。

1.5.2 發(fā)酵液中PQQ質(zhì)量濃度的檢測

發(fā)酵液中PQQ質(zhì)量濃度的檢測采用高效液相色譜法,將發(fā)酵液樣品5 000 r/min離心10 min,取上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾,濾液進樣HPLC測定。色譜條件為,色譜柱:Waters XBridge C18 Column(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-水(B,用三氟乙酸調(diào)節(jié)pH值至1.0);洗脫條件(表1);流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長365.8 nm;進樣量10 μL[20]。

表1 洗脫條件Table 1 Elution conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 PQQ補料分批發(fā)酵

PQQ補料分批發(fā)酵實驗中發(fā)酵液初始體積為30 L,發(fā)酵264 h結(jié)束發(fā)酵放罐,放罐發(fā)酵液的發(fā)酵單位為1 588 mg/L,放罐體積約35 L,共消耗碳源甲醇6 620 mL。每天的發(fā)酵單位、OD600值和補料的甲醇體積如表2所示。

2.2 PQQ補料分批發(fā)酵的過程分析

將表2中的發(fā)酵單位、OD600值繪制成發(fā)酵增長曲線,如圖1所示。整個補料分批發(fā)酵的周期較長,共264 h,發(fā)酵前期(0～120 h),菌體生長較慢,消耗了大量的時間用于將菌體增殖到較高的濃度;發(fā)酵中期(120～192 h),發(fā)酵液OD600值達到40左右時,發(fā)酵單位的增長速度是最快的;發(fā)酵后期(192～264 h),發(fā)酵液OD600值增加到50以上后,發(fā)酵單位增長逐漸停滯。

表2 PQQ補料分批發(fā)酵每天OD600值、發(fā)酵 單位和碳源甲醇補料量Table 2 Date of PQQ fed-batch fermentation

PQQ補料分批發(fā)酵PQQ產(chǎn)量和甲醇消耗量,如圖2所示。在發(fā)酵前期和后期,PQQ的生產(chǎn)效率低,而且甲醇單耗較高;在發(fā)酵中期144～192 h,PQQ的生產(chǎn)效率高,同時甲醇單耗最低。PQQ發(fā)酵生產(chǎn)的原料成本主要來自于甲醇,如果能將發(fā)酵周期中144～192 h的發(fā)酵液最佳生產(chǎn)狀態(tài)延長,不僅能夠提高PQQ生產(chǎn)效率,還將降低碳源甲醇的單位消耗,從而降低生產(chǎn)成本。

圖2 PQQ補料分批發(fā)酵PQQ產(chǎn)量和甲醇消耗量Fig.2 PQQ yield and methanol consumption of PQQ fed-batch fermentation

2.3 PQQ連續(xù)發(fā)酵

根據(jù)以上對PQQ補料分批發(fā)酵的分析考慮用連續(xù)發(fā)酵的方式來延長最佳生產(chǎn)狀態(tài),綜合考慮,以補料分批發(fā)酵168 h時為連續(xù)發(fā)酵的起點(發(fā)酵液OD600值40.5,PQQ的質(zhì)量濃度為1 022 mg/L),通過計算稀釋率用蠕動泵以一定的速率連續(xù)補入甲醇、氨水和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,同時用蠕動泵以一定的速率從發(fā)酵罐底部連續(xù)放出發(fā)酵液。

在連續(xù)發(fā)酵過程中,底物的補加速率會顯著影響菌體的生長和產(chǎn)物的生產(chǎn),因此稀釋率是連續(xù)發(fā)酵的一個重要影響因素。在PQQ補料分批發(fā)酵中,發(fā)酵后期PQQ的產(chǎn)量下降,甲醇轉(zhuǎn)化率也下降,分析有兩個可能的原因,一個可能的原因是由于菌體不停增殖,菌體濃度過高導(dǎo)致菌體衰亡,造成PQQ的生產(chǎn)能力下降;另一個可能的原因是由于產(chǎn)物PQQ的質(zhì)量濃度不斷增高引起了反饋抑制,造成PQQ的生產(chǎn)能力下降。針對這兩個可能的原因,就有兩種稀釋率方案,一種是恒濁法的稀釋率,即維持發(fā)酵液菌體濃度(OD600值)恒定,以延緩菌體衰老;另一種是產(chǎn)物恒化法的稀釋率,即維持發(fā)酵液中產(chǎn)物PQQ的質(zhì)量濃度(發(fā)酵單位)恒定,以解除產(chǎn)物反饋抑制。

2.3.1 恒濁法連續(xù)發(fā)酵

PQQ的恒濁法連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)中,先沿用補料分批發(fā)酵工藝將發(fā)酵液培養(yǎng)到168 h,再轉(zhuǎn)為恒濁法連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),即通過額外補料基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵液進行稀釋,使發(fā)酵液中菌體濃度保持恒定。補料總速率按照以下步驟計算:

首先按照表2中的數(shù)據(jù)計算補料分批發(fā)酵在144～192 h的菌體比生長速率,近似為168 h時的菌體比生長速率,如公式(1)所示:

(1)

式中:μ,比生長速率,h-1;x,發(fā)酵液的OD600值;t,發(fā)酵時間,h。

由于要使菌體濃度維持恒定,則單級恒濁法連續(xù)發(fā)酵中,菌體的比生長速率和稀釋率相等[21],如公式(2)所示:

(2)

式中:D,稀釋率,h-1;F,料液流速,L/h;V,培養(yǎng)體積,L。

補料分批發(fā)酵到168 h時,發(fā)酵液體積為34.2 L,因此可以計算恒濁法的補料總速率,如公式(3)所示:

F=D×V=0.008 7 h-1×34.2 L=0.297 L/h

(3)

恒濁法連續(xù)發(fā)酵實驗前期的工藝與補料分批發(fā)酵完全相同,到168 h時補碳源甲醇的速率為37.5 mL/h,補氨水的速率為3.5 mL/h,因此在恒濁法連續(xù)發(fā)酵開始時補甲醇和補氨水的速率不變,另外以256 mL/h的速率用蠕動泵連續(xù)補基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基到罐中,以297 mL/h的速率用蠕動泵從罐底連續(xù)放料,連續(xù)發(fā)酵312 h后,PQQ的日產(chǎn)量下降明顯,于是結(jié)束連續(xù)發(fā)酵放罐。發(fā)酵總過程持續(xù)了480 h,共消耗碳源甲醇15 960 mL,恒濁法連續(xù)發(fā)酵過程中OD600值和發(fā)酵單位增長情況如圖3所示。

圖3 PQQ恒濁法連續(xù)發(fā)酵中發(fā)酵液OD600值 和發(fā)酵單位增長曲線Fig.3 OD600 and PQQ concentration curve of PQQ turbidostat

PQQ恒濁法連續(xù)發(fā)酵PQQ產(chǎn)量和甲醇消耗量,如圖4所示。

圖4 PQQ恒濁法連續(xù)發(fā)酵PQQ產(chǎn)量和甲醇消耗量Fig.4 PQQ yield and methanol consumption of PQQ turbidostat

2.3.2 恒化法連續(xù)發(fā)酵

本文中的PQQ恒化法連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),是將發(fā)酵液中的產(chǎn)物PQQ質(zhì)量濃度保持恒定,先沿用補料分批發(fā)酵工藝將發(fā)酵液培養(yǎng)到168 h,再轉(zhuǎn)為恒化法連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),即通過額外補料基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵液進行稀釋,使發(fā)酵液中PQQ質(zhì)量濃度保持恒定。補料總速率按照以下步驟計算:

先按照表2中的數(shù)據(jù)計算補料分批發(fā)酵在144～192 h階段的比產(chǎn)物生成速率,近似為168 h時的比產(chǎn)物生成速率,如公式(4)所示:

(4)

式中:μρ,比產(chǎn)物生成速率,h-1;ρ,發(fā)酵液中產(chǎn)物PQQ的質(zhì)量濃度,mg/L;t,發(fā)酵時間,h。

要維持發(fā)酵液中PQQ的質(zhì)量濃度恒定,則單級恒化法連續(xù)發(fā)酵中的稀釋率應(yīng)等于比產(chǎn)物生成速率,如公式(5)所示:

(5)

式中:D,稀釋率,h-1;F,料液流速,L/h;V,培養(yǎng)體積,L。

補料分批發(fā)酵到168 h時,發(fā)酵液體積為34.2 L,因此可以計算出恒化法的補料總速率,如公式(6)所示:

F=D×V=0.013 4 h-1×34.2 L=0.458 L/h

(6)

恒化法連續(xù)發(fā)酵實驗前期的工藝也與補料分批發(fā)酵完全相同,到168 h時補碳源甲醇的速率為37.5 mL/h,補氨水的速率為3.5 mL/h,因此在恒化法連續(xù)發(fā)酵開始時補甲醇和補氨水的速率不變,另外以417 mL/h的速率用蠕動泵連續(xù)補基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基到罐中,以458 mL/h的速率用蠕動泵從罐底連續(xù)放料,連續(xù)發(fā)酵312 h后,發(fā)酵液OD600值下降較多,PQQ的日產(chǎn)量逐漸降低,于是結(jié)束連續(xù)發(fā)酵放罐,發(fā)酵總過程持續(xù)了480 h共消耗碳源甲醇15 370 mL,恒化法連續(xù)發(fā)酵過程中OD600值和發(fā)酵單位增長情況如圖5所示。

圖5 PQQ恒化法連續(xù)發(fā)酵中發(fā)酵液OD600值和 發(fā)酵單位增長曲線Fig.5 OD600 and PQQ concentration curve of PQQ chemostat

PQQ恒化法連續(xù)發(fā)酵PQQ產(chǎn)量和甲醇消耗量,如圖6所示。

圖6 PQQ恒化法連續(xù)發(fā)酵PQQ產(chǎn)量和甲醇消耗量Fig.6 PQQ yield and methanol consumption of PQQ chemostat

2.3.3 三種發(fā)酵方法的對比

將PQQ的補料分批發(fā)酵和恒濁法、恒化法連續(xù)發(fā)酵的發(fā)酵總產(chǎn)量和甲醇總消耗量列于表3中。

根據(jù)表3中的數(shù)據(jù),得出3種發(fā)酵方法的生產(chǎn)效率和甲醇平均轉(zhuǎn)化率,如圖7所示。

表3 三種發(fā)酵方法的發(fā)酵產(chǎn)量和甲醇消耗量Table 3 PQQ yield and methanol consumption of 3 types of fermentation

圖7 PQQ 3種發(fā)酵方法的生產(chǎn)效率和甲醇轉(zhuǎn)化率的對比Fig.7 PQQ productivity and methanol conversion ratio of 3 types of fermentation

2種PQQ連續(xù)發(fā)酵方法的生產(chǎn)效率和甲醇平均轉(zhuǎn)化率都遠高于PQQ補料分批發(fā)酵,其中又以恒濁法連續(xù)發(fā)酵更優(yōu)。在恒濁法連續(xù)發(fā)酵過程中,發(fā)酵單位可以達到比分批發(fā)酵高的多,說明在補料分批發(fā)酵過程中,發(fā)酵后期阻礙發(fā)酵單位繼續(xù)增長的主要原因是菌體濃度累積的過高,造成菌體衰亡,而發(fā)酵產(chǎn)物PQQ的反饋抑制則是次要原因。在恒化法連續(xù)發(fā)酵過程中,由于稀釋率過大,發(fā)酵液OD600值一直在下降,即菌體濃度下降,影響了產(chǎn)PQQ效率。因此用恒濁法連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)PQQ,可以維持合適的菌體濃度,大大延長了穩(wěn)定期,從而維持了較高的產(chǎn)PQQ效率,又有部分解除產(chǎn)物抑制的效果,是較優(yōu)的PQQ發(fā)酵方法。

3 結(jié)論與討論

PQQ補料分批發(fā)酵過程中,菌體增殖的問題是貫穿始終的,發(fā)酵前期需要等待菌體緩慢增殖,該階段菌體濃度還比較低,所以產(chǎn)PQQ效率也很低;發(fā)酵中期,菌體增殖到了合適的濃度,產(chǎn)PQQ效率也達到了高峰;到了發(fā)酵后期,由于菌體持續(xù)增殖,過高的菌體濃度造成菌體衰亡過快,產(chǎn)PQQ效率又迅速下降;綜合來看,PQQ補料分批發(fā)酵中,穩(wěn)定期較短,高效產(chǎn)PQQ期較短,造成整體生產(chǎn)效率較低。

本研究發(fā)現(xiàn),以0.008 7 h-1的稀釋率進行PQQ恒濁法單級連續(xù)發(fā)酵,能夠較長時間維持發(fā)酵液合適的菌體濃度,延長了穩(wěn)定期,從而較長時間維持PQQ的高效生產(chǎn)期,大幅提升了整體生產(chǎn)效率。與補料分批發(fā)酵相比,該恒濁法連續(xù)發(fā)酵可以提高PQQ的生產(chǎn)效率(80.7%),同時還提高了底物甲醇的轉(zhuǎn)化率(36.5%),具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。