陳 靈,欒慶祥,黃 鑫,金曉峰,趙 貴
(貴州省獸藥飼料檢測(cè)所,貴州貴陽(yáng) 550003)
馬波沙星(Marbofloxacin,MBF) 屬于氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物,通過(guò)抑制細(xì)菌DNA 回旋酶活性,阻止其DNA 的合成復(fù)制,進(jìn)而發(fā)揮抗菌作用,對(duì)革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌和支原體表現(xiàn)出良好的抗菌效果[1-3]。馬波沙星給藥后吸收迅速完全,體內(nèi)分布廣泛,生物利用度高,作用于體內(nèi)多個(gè)組織[4-7];常用于牛的呼吸道感染和急性乳房炎,豬的無(wú)乳綜合癥,以及犬貓的感染性疾病[8-13]。
目前,針對(duì)馬波沙星的檢測(cè)方法主要涉及酶聯(lián)免疫法[14-15]、膠體金免疫層析[16]、表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS)[17]、熒光探針?lè)╗18]、液相色譜法[19-21]、高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法[22-23]。其中,液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn),對(duì)馬波沙星的殘留分析具有較大的優(yōu)勢(shì)。在馬波沙星的已有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[24-25]中,也使用了液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法,但方法的前處理過(guò)程較為繁瑣,各方法能檢測(cè)的樣品種類(lèi)少,不能較好地滿(mǎn)足多種類(lèi)樣品的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。鑒于馬波沙星常被應(yīng)用于多種動(dòng)物的疾病治療,在動(dòng)物體內(nèi)分布于多個(gè)靶組織中,需要一種能涵蓋多種動(dòng)物組織的檢測(cè)方法。因此,建立了一種簡(jiǎn)便快捷、高效靈敏且能滿(mǎn)足多種動(dòng)物組織中馬波沙星檢測(cè)的HPLC-MS/MS 方法,為保證動(dòng)物性食品的質(zhì)量安全和馬波沙星的后續(xù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)研究提供技術(shù)支撐。
(1) 儀器。AB Sciex Triple 6500+三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀,上海SCIEX 分析儀器貿(mào)易有限公司產(chǎn)品;全自動(dòng)智能氮吹儀、多樣品旋渦混合器,廣州得泰公司產(chǎn)品;ACQUITY HSS T3 型色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),美國(guó)沃特世公司產(chǎn)品;3K15 型高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品;KQ-500 DE產(chǎn)品數(shù)控超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品;0.22 μm wwPTFE 微孔濾膜,美國(guó)PALL 公司產(chǎn)品;Milli-Q Direct-Q10 產(chǎn)品超純水機(jī),美國(guó)默克密理博公司產(chǎn)品。
(2) 試劑。乙腈(色譜級(jí)),美國(guó)默克公司提供;甲醇(質(zhì)譜級(jí)),美國(guó)Fisher 公司提供;甲酸(質(zhì)譜級(jí)),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供;乙酸(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;正己烷(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;試驗(yàn)用超純水為Milli-Q Direct-Q10 超純水機(jī)制備。
馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)品(純度96%),加拿大Toronto Research Chemicals 公司提供;馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%),中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。
試驗(yàn)用的牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、牛奶、豬肉、豬肝、豬腎、豬脂肪等9 種樣品,均購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱(chēng)取馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用乙腈溶解并稀釋至10 mL 容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備液,0 ℃以下避光保存;準(zhǔn)確稱(chēng)取馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg,用乙腈溶解并稀釋至10 mL 容量瓶中,得50 μg/mL 馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)貯備液,0 ℃以下避光保存。
(2) 標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確量取馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL,于100 mL 容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)中間液;準(zhǔn)確量取馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL,于5 mL 容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)中間液。
(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。準(zhǔn)確量取馬波沙星中間液和馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)中間液適量,用0.1%甲酸水+甲醇(9+1) 配制成馬波沙星質(zhì)量濃度為5,20,50,100,200,400 μg/L,馬波沙星-D8質(zhì)量濃度均為10 μg/L 的馬波沙星系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.2.2 樣品的前處理
牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、豬肉、豬肝、豬腎和豬脂肪均搗碎均質(zhì)后使用,牛奶直接使用。
(1) 樣品提取。稱(chēng)取試料2 g(準(zhǔn)確至0.02 g),置于50 mL 離心管中,加入1 μg/mL 的馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)中間液20 μL,加入8 mL 的1%乙酸乙腈溶液,渦旋0.5 min,超聲振蕩10 min,于低溫5 ℃下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min,取上清液轉(zhuǎn)入到另一10 mL 離心管中,于50 ℃下氮?dú)獯蹈?,?zhǔn)確加入2 mL 的0.1%甲酸水+甲醇(9+1) 復(fù)溶,待凈化。
(2) 樣品凈化。于復(fù)溶液中加入正己烷4 mL,渦旋1 min,于低溫5 ℃下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min,取下層溶液過(guò)0.2 μm 有機(jī)濾膜,供高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。
1.2.3 色譜條件
色譜柱為Waters ACQUITY HSS T3 色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流速0.3 mL/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量1 μL,流動(dòng)相A 為0.1 %甲酸水,B 為乙腈,梯度洗脫0~0.5 min,95%A;0.5~6.5 min,95%~80%A;6.5~7.0 min,80%~10%A;7.0~7.1 mim,10%~95%A;7.1~9.0 min,95%A。
1.2.4 質(zhì)譜條件
電噴霧離子源(ESI):正離子掃描;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),噴霧電壓5.5 kV,氣簾氣40 psi,噴霧氣45 psi,輔助氣40 psi,離子源溫度500 ℃。
馬波沙星和馬波沙星-D8的MRM參數(shù)見(jiàn)表1。
表1 馬波沙星和馬波沙星-D8 的MRM 參數(shù)
2.1.1 質(zhì)譜條件的確定
馬波沙星屬于氟喹諾酮類(lèi)藥物,分子結(jié)構(gòu)含有多個(gè)N 原子而顯一定的弱堿性,因此選擇正離子模式電離。分別取質(zhì)量濃度1 μg/mL 的馬波沙星和1 μg/mL 的馬波沙星-D8溶液進(jìn)行全掃描,得到相應(yīng)的準(zhǔn)分子離子分,確定母離子。調(diào)整電離電壓和離子源溫度使母離子響應(yīng)值最佳,最終確定電離電壓為5.5 kV,離子源溫度為500 ℃。對(duì)母離子進(jìn)行子離子全掃描,確定定量離子對(duì)和定性離子對(duì),并優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量,確定最佳參數(shù)。
2.1.2 色譜條件的確定
馬波沙星極性弱,具有良好的脂溶性,在反相C18色譜柱上具有良好的保留,選擇具有高分離能力、高耐壓性和pH 值適用范圍廣的Waters ACQUITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm) 色譜柱,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在該色譜柱條件下,目標(biāo)化合物分離效果好、峰型尖銳對(duì)稱(chēng)。試驗(yàn)比較了水- 甲醇、水- 乙腈、0.1%甲酸水- 甲醇和0.1%甲酸水- 乙腈4 種流動(dòng)相體系下的色譜峰形及響應(yīng)值,發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸水- 乙腈作流動(dòng)相時(shí),目標(biāo)化合物具有良好的響應(yīng),保留穩(wěn)定、峰型好,柱壓也較低,因此確定0.1%甲酸水- 乙腈為流動(dòng)相。在此條件下,馬波沙星MRM總離子流色譜圖。
馬波沙星的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 馬波沙星的總離子流色譜圖
動(dòng)物肌肉、內(nèi)臟、脂肪和生鮮乳中含量較高的蛋白質(zhì)和脂肪,對(duì)目標(biāo)物的提取和后續(xù)的檢測(cè)有較大的干擾,提取溶劑應(yīng)能最大限度地減少此類(lèi)物質(zhì)的提出。在常用的提取溶劑中,因馬波沙星在乙腈中具有良好的溶解性,且乙腈具有一定的蛋白沉淀作用,高速離心后可去除一定量的蛋白,同時(shí)乙腈能減少對(duì)脂肪的提取,因此選擇乙腈作為提取溶劑,能獲較好的回收率。由于馬波沙星的分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)N 原子,具有弱堿性,加入適量的乙酸使其離子化,增加極性,有利于提高馬波沙星在乙腈中的溶解度,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用1%的乙酸乙腈提取時(shí),在有效去除干擾雜質(zhì)的同時(shí)能獲得良好的回收率。最終確定1%的乙酸乙腈作為提取溶劑。
試驗(yàn)比較了3 種凈化方式:一是樣品經(jīng)1%乙酸乙腈提取、氮?dú)獯蹈伞?.1%甲酸水+甲醇(9+1) 復(fù)溶處理后,復(fù)溶液過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜后直接上機(jī)測(cè)定;二是樣品經(jīng)1%乙酸乙腈提取后,加入適量正己烷除脂,氮?dú)獯蹈桑?.1%甲酸水+甲醇(9+1) 復(fù)溶后過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜;三是樣品經(jīng)1%乙酸乙腈提取、氮?dú)獯蹈伞?.1%甲酸水+甲醇(9+1) 復(fù)溶后,復(fù)溶液經(jīng)正己烷脫脂,取下層溶液過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),方法一未能有效地達(dá)到凈化的目的,得到的色譜圖雜峰較多、干擾大,較多的雜質(zhì)還可能對(duì)儀器造成污染及損害;方法二和方法三得到的色譜圖基本一致,雜峰少、干擾小,但方法二需要消耗更多量的正己烷,綜合考慮凈化效果、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等因素,最終確定復(fù)溶后再脫脂的凈化方式。
分別考查了乙腈:0.1%甲酸水(20∶80,V∶V)、乙腈:0.1%甲酸水(10∶90,V∶V)、甲醇:0.1%甲酸(20∶80,V∶V)、甲醇:0.1%甲酸水(10∶90,V∶V) 等4 種溶劑作為樣品氮?dú)獯蹈珊蟮膹?fù)溶液,對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)值和峰型的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)復(fù)溶液中有機(jī)相為乙腈時(shí),雖然色譜峰峰型較好,但背景干擾比有機(jī)相為甲醇的復(fù)溶液時(shí)的背景干擾高;而當(dāng)有機(jī)相為甲醇時(shí),過(guò)高甲醇濃度會(huì)抑制目標(biāo)物的響應(yīng)。因此,最終確定樣品復(fù)溶液為甲醇:0.1%甲酸水(10∶90,V∶V)。
2.5.1 線性范圍和定量限、檢出限
取“1.3.1”制備的馬波沙星質(zhì)量濃度為5,20,50,100,200,400 μg/L,馬波沙星-D8質(zhì)量濃度均為10 g/L 的馬波沙星系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,供液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定,以馬波沙星與馬波沙星-D8的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y),馬波沙星的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,在5.0~400.0 ng/mL 的濃度范圍內(nèi),馬波沙星呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=0.235 67X-0.286 85,相關(guān)系數(shù)(R) 為0.999 6。在各基質(zhì)中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以信噪比S/N>3,確定檢出限(Limit of Detection,LOD) 為1.5 μg/kg;以信噪比S/N>10,確定量限(Limit of quantitation,LOQ) 為5.0 μg/kg。
2.5.2 準(zhǔn)確度和精密度
采用添加回收的方法考查該方法的準(zhǔn)確度和精密度。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)獸藥殘留檢測(cè)方法精密度和準(zhǔn)確度的規(guī)定[26],分別在豬肌肉、肝臟、腎臟和脂肪,以及牛肌肉、脂肪、肝臟、腎臟和牛奶的空白基質(zhì)中添加適量馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液,每種空白基質(zhì)添加4 個(gè)質(zhì)量濃度水平,每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3 批試驗(yàn),每批5 個(gè)平行樣品,按“1.3”的試驗(yàn)方法進(jìn)行前處理測(cè)定,分別計(jì)算每批單獨(dú)試驗(yàn)的批內(nèi)平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 和全部批次的批間平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。
馬波沙星的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表2。
由表2 可知,肌肉、肝臟、腎臟添加質(zhì)量濃度為5.0~300.0 μg/kg 時(shí)、脂肪添加質(zhì)量濃度為5.0~100.0 μg/kg 時(shí)、牛奶添加質(zhì)量濃度為5.0~150.0 μg/kg時(shí),馬波沙星的平均回收率為82.6%~108.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%~6.86%,該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。
使用該方法對(duì)市場(chǎng)采購(gòu)的牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、牛奶、豬肉、豬肝、豬腎、豬脂肪等各10 批樣品進(jìn)行檢測(cè),均未檢出馬波沙星。
建立了一種能同時(shí)滿(mǎn)足牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、牛奶、豬肉、豬肝、豬腎和豬脂肪等9 種動(dòng)物基質(zhì)中馬波沙星殘留檢測(cè)的高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、涵蓋多種動(dòng)物組織,適用于動(dòng)物源性食品中馬波沙星殘留的快速檢測(cè)。