王佳新，張 熙，劉子夜，閆 茜，王曉艷，劉美玉

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2.邯鄲市天然產(chǎn)物與功能性食品開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北邯鄲 056038）

我國禽蛋的生產(chǎn)和消費(fèi)總產(chǎn)量從1985 年開始，連續(xù)30 多年位居世界第一，2019 年雞蛋總量約3 500 萬t，占世界雞蛋總產(chǎn)量的40%以上。蛋殼占雞蛋質(zhì)量的12%～13%[1]，往往作為廢棄物被扔掉。據(jù)估計(jì)，我國每年有廢棄蛋殼約400 萬t，不僅造成環(huán)境污染，也是一種資源浪費(fèi)[2]，目前國內(nèi)對雞蛋殼的深加工利用開始備受關(guān)注。蛋殼的主要成分是CaCO3（含量90%以上），是一種天然綠色生物鈣源，充分利用好這一優(yōu)質(zhì)鈣源，變廢為寶，對建設(shè)資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會具有現(xiàn)實(shí)意義。

鈣是人體必需的元素之一，是組成骨骼、牙齒、臟器、血液和肌肉組織的重要成分[3]，缺鈣會引起各種生理功能障礙。鈣元素以離子態(tài)被人體吸收的被稱為活性鈣[4]。蛋殼的主要成分為碳酸鈣（約占93.0%），不易被機(jī)體吸收利用，如把蛋殼中無機(jī)鈣轉(zhuǎn)化成活性鈣，將大大增加蛋殼的利用率。近年國內(nèi)外研究者采用高溫煅燒法[5]、直接中合法[6]、微生物轉(zhuǎn)化[7]等把蛋殼鈣轉(zhuǎn)化成檸檬酸鈣[8]、醋酸鈣[9]、乳酸鈣[10]、葡萄糖酸鈣[11]及氨基酸鈣[12]等產(chǎn)品，取得了一定成效，上述制作方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，產(chǎn)率和有效鈣含量有待于進(jìn)一步提高。

乳酸鈣（C6H10CaO6） 是具有安全性高、溶解度大、吸收率高等優(yōu)點(diǎn)的一種有機(jī)鈣，在所有鈣鹽中人體對乳酸鈣吸收率最高，可達(dá)32%[13]。在食品工業(yè)中乳酸鈣用于食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑的鈣劑，作為面包、糕點(diǎn)等的緩沖劑、膨松劑等[14]；在醫(yī)藥行業(yè)作為藥物使用[15]，可治療缺鈣癥，如佝僂病、手足搐搦癥，以及婦女妊娠、哺乳期所需鈣的補(bǔ)充[16]。

響應(yīng)面法（RSM） 是利用多元二次回歸方程來擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過分析回歸方程找到最佳工藝參數(shù)[17]，具有周期短、試驗(yàn)次數(shù)少等特點(diǎn)，能有效節(jié)省時(shí)間和成本；還可通過對二次方程模型的擬合與方差分析，評價(jià)每個(gè)因子及其交互作用對所得去除率的影響，從而可快速有效地預(yù)測多因子系統(tǒng)的最佳條件[18]。利用直接中和法把蛋殼鈣轉(zhuǎn)化成有機(jī)乳酸鈣，并用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，旨在為蛋殼綜合利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原材料：雞蛋殼，河北省邯鄲市美食林工業(yè)園提供。

試劑：鈣羧酸指示劑（含量≥98%） 分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠提供；氫氧化鈉（含量≥98%，分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（99.5%，分析純），天津歐博凱化工有限公司提供；乳酸（＞88%，食品級），天津市歐波凱化工有限公司提供；鹽酸（36%～38%，分析純），煙臺市雙雙化工有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)分樣篩（100 目），浙江上虞市道墟張興紗篩廠產(chǎn)品；FD-1 型冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；2XZ-2 型旋片真空泵，浙江黃巖求精真空泵廠產(chǎn)品；F-1000 型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，新昌縣德科機(jī)械有限公司產(chǎn)品；JA1003 型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司產(chǎn)品；DGG-9146A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博珍儀器設(shè)備制造廠產(chǎn)品；85-2 型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋殼粉制備

挑選干凈、殼色均勻一致的雞蛋殼，洗凈后在清水中浸泡2～3 h，蛋殼膜大部分已經(jīng)與蛋殼分離，順勢撕下蛋殼膜，再次清洗蛋殼，攤放在30 ℃烘箱中烘干3～4 h；放入粉碎機(jī)粉碎，過100 目篩后放入燒杯，加入30 倍蒸餾水，磁力攪拌10 min，靜置20 min，除掉上層懸浮物，再次抽濾，棄濾液，取上層物冷凍干燥，再次過100 目篩，即為制備好的蛋殼粉，備用。

1.3.2 中和反應(yīng)

稱取適量蛋殼粉置于燒杯中，先加入一定量的乳酸，再緩慢分次加入一定量的蒸餾水，邊加水邊攪拌，以防反應(yīng)時(shí)液體溢出；在一定的水浴溫度下，經(jīng)過一定時(shí)間使其充分反應(yīng)，至無氣泡產(chǎn)生則為反應(yīng)完全。反應(yīng)方程式如下：2CH3CH（OH） COOH+CaCO3=(CH3CH(OH)COO)2Ca+H2O+CO2↑。待反應(yīng)完全后將水浴鍋升溫至80 ℃，使生成的乳酸鈣溶解，并趁熱抽濾去除雜質(zhì)，取濾液冷凍干燥，粉碎過篩，即得白色粉末狀乳酸鈣。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別選取乳酸用量、料液比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考查不同因素對乳酸鈣產(chǎn)量的影響。準(zhǔn)確稱取制備好的蛋殼粉3 g，精確到0.01 g，置于燒杯中，先固定試驗(yàn)條件為料液比1∶14，反應(yīng)溫度45 ℃，反應(yīng)時(shí)間為90 min，設(shè)計(jì)乳酸用量，其次設(shè)計(jì)料液比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度。

單因素試驗(yàn)水平編碼表見表1。

表1 單因素試驗(yàn)水平編碼表

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乳酸用量、料液比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度為考查因素，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)，以乳酸鈣產(chǎn)量為響應(yīng)值，每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平，采用四因素三水平的Box-behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

響應(yīng)面分析因素水平編碼見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素水平編碼

1.3.5 乳酸鈣產(chǎn)量的測定方法

（1） 試劑配置。鹽酸溶液（1 份鹽酸+ 4 份水）；氫氧化鈉溶液（100 g/L）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA） 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.05 mol/L）；鈣試劑羧酸鈉指示劑（稱取0.1 g 鈣試劑羧酸鈉鹽，加10 g 在110 ℃干燥過的氯化鈉，研磨，混勻）。

（2） 乳酸鈣（C6H10CaO6） 含量（以干基計(jì)） 的測定步驟：稱取約0.3 g 試樣，溶于已加有2 mL 鹽酸溶液的50 mL 水中，邊攪拌邊滴加乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液15 mL，再加氫氧化鈉溶液5 mL和鈣試劑羧酸鈉指示劑0.1 g，用乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，滴定溶液至呈現(xiàn)藍(lán)色為終點(diǎn)。乳酸鈣（C6H10CaO6） 含量（以干基計(jì)） 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)W1，按照公式（1） 計(jì)算：

式中：V1——試樣消耗乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；

1 000——換算因子；

C1——乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；

M1——乳酸鈣的摩爾質(zhì)量，g/mol，[M1(C6H10CaO6)=218.2]；

m1——試樣的質(zhì)量，g；

W2——干燥減量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

取2 次平行測定結(jié)果的平均值為測定結(jié)果。

乳酸鈣（C6H10CaO6） 的實(shí)際產(chǎn)量結(jié)果，按照公式（2） 計(jì)算：

式中：W1——樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

W2——蛋殼和乳酸反應(yīng)后干燥得到的乳酸鈣總質(zhì)量，g。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，p＜0.05 表示差異顯著；并進(jìn)行相關(guān)性分析和多重回歸分析，建立回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸用量對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

在料液比1∶14，反應(yīng)時(shí)間90 min，反應(yīng)溫度45 ℃的條件下，不同的乳酸用量對乳酸鈣產(chǎn)量的影響。

乳酸用量對乳酸鈣產(chǎn)量的影響見圖1。

圖1 乳酸用量對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

由圖1 可知，隨著乳酸用量的增加，乳酸鈣的產(chǎn)量隨之升高，生成的乳酸鈣是一種無異味的白色結(jié)晶體。當(dāng)乳酸用量達(dá)到6 mL 時(shí)，乳酸鈣產(chǎn)量最高為5.86 g；當(dāng)乳酸用量繼續(xù)增加至7 mL，乳酸鈣產(chǎn)量沒有顯著性增加，這是因?yàn)槿樗崤c蛋殼已反應(yīng)完全，但過量的乳酸形成具有吸濕性的乳酸酐吸附在乳酸鈣表面，干燥時(shí)生成微黃色具有酸味的晶體，使乳酸鈣的品質(zhì)降低[6]，并且造成材料上的浪費(fèi)。因此，7 mL 乳酸反應(yīng)效果比較適宜。

2.2 料液比對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

料液比是指蛋殼粉與水的質(zhì)量之比。在確定乳酸用量為6 mL 條件下，暫定反應(yīng)時(shí)間90 min，反應(yīng)溫度45 ℃，測定不同料液比對乳酸鈣產(chǎn)量的影響。

料液比對乳酸鈣產(chǎn)量的影響見圖2。

圖2 料液比對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

乳酸鈣產(chǎn)量隨著料液比的增大而增大，當(dāng)增至1∶14 時(shí)，產(chǎn)量最高為4.97 g。料液比再增加時(shí)，產(chǎn)量又逐漸下降趨勢。因?yàn)殡u蛋殼與乳酸的反應(yīng)屬多相反應(yīng)體系，既有液相又有固相，且生成的產(chǎn)物乳酸鈣易溶于水，進(jìn)入液相。料液比太小會導(dǎo)致乳酸的濃度大，使反應(yīng)體系的溶液易達(dá)到飽和，不利于乳酸鈣的生成，因此增大料液比有利于反應(yīng)向生成乳酸鈣的方向進(jìn)行。但料液比太大會降低乳酸濃度，并且會造成后期蒸發(fā)濃縮時(shí)間延長，能耗增加。另外，當(dāng)反應(yīng)體系中水量較多時(shí)，結(jié)晶過濾過程中也會使乳酸鈣損失較大，降低乳酸鈣的產(chǎn)量[19]。因此，料液比選1∶14 較合適。

2.3 反應(yīng)溫度對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

在確定乳酸用量6 mL，料液比1∶14 的條件下，暫定反應(yīng)時(shí)間為90 min，測定不同的反應(yīng)溫度對乳酸鈣產(chǎn)量的影響。

反應(yīng)溫度對乳酸鈣產(chǎn)量的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

在25～45 ℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，乳酸鈣產(chǎn)量也緩慢增加，當(dāng)反應(yīng)溫度為45 ℃，其產(chǎn)量最高為5.32 g；溫度繼續(xù)升高，乳酸鈣產(chǎn)量逐漸下降。這是因?yàn)闇囟壬撸涌旆磻?yīng)速度，乳酸鈣生成量增加，并有利于CO2氣體的溢出；但溫度過高，會使水和乳酸蒸發(fā)加快，導(dǎo)致乳酸損失，不能充分利用，而影響乳酸鈣的產(chǎn)量[20]。因此，制備乳酸鈣的最佳反應(yīng)溫度為45 ℃。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

在確定乳酸用量6 mL，料液比1∶14，反應(yīng)溫度45 ℃的條件下，測定不同的反應(yīng)時(shí)間對乳酸鈣產(chǎn)量的影響。

反應(yīng)時(shí)間對乳酸鈣產(chǎn)量的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

由圖4 可知，乳酸鈣的產(chǎn)量隨著反應(yīng)時(shí)間的增大而增加，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到90 min 時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最高5.28 g。由于碳酸鈣與乳酸為弱堿與弱酸反應(yīng)，反應(yīng)速度慢，較短的反應(yīng)時(shí)間會導(dǎo)致乳酸與碳酸鈣反應(yīng)不充分，造成乳酸和蛋殼粉等材料的浪費(fèi)；反應(yīng)時(shí)間到90 min 時(shí)，乳酸和蛋殼粉的反應(yīng)完全，乳酸鈣產(chǎn)量達(dá)到最高；之后再延長反應(yīng)時(shí)間，乳酸鈣產(chǎn)量增加不顯著。為保證乳酸與蛋殼粉充分完全反應(yīng)，并提高試驗(yàn)效率。因此，反應(yīng)時(shí)間選90 min 為宜。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取乳酸用量（A），料液比（B），反應(yīng)溫度（C），反應(yīng)時(shí)間（D） 作為試驗(yàn)因素，篩選乳酸鈣的最優(yōu)制備工藝條件。采用Design Expert V 8.0.6 軟件中的Box-behnken 設(shè)計(jì)并進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對表3 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到各因素與響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為：

方差分析見表4。

表4 方差分析

根據(jù)p值的大小可以顯示模型及其各個(gè)考查因素的顯著水平。當(dāng)p＜0.05 時(shí)，表明該模型或其各因素影響顯著，p＜0.01 時(shí)，表明該模型或其各因素影響極顯著。由表4 可知，蛋殼制取乳酸鈣產(chǎn)量為響應(yīng)值時(shí)，該模型p＜0.000 1，表明該二次方程模型極顯著；且失擬項(xiàng)p=0.180 9＞0.05 不顯著，R2=0.945 0，R2Adj=0.889 9 和Adeq.Precision=15.477 表明該二次多項(xiàng)回歸方程的模擬度較好，誤差小，從而可采用此方法對雞蛋殼乳酸鈣制取工藝參數(shù)進(jìn)行預(yù)測和分析。

變異系數(shù)CV 可以反映模型的可信度，當(dāng)CV 值越低時(shí)，模型的可信度越高。該試驗(yàn)的CV=2.98%，表明該模型的可信度較高，可以用該模型來分析響應(yīng)值的變化。

由表4 還可知，因素一次項(xiàng)A、C對乳酸鈣產(chǎn)量指標(biāo)的影響為極顯著水平（p＜0.01），一次項(xiàng)B、D對試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著（p＞0.05）。根據(jù)F值的大小可得知，4 個(gè)因素對蛋殼制取乳酸鈣產(chǎn)量的影響大小順序?yàn)锳＞C＞B＞D，即乳酸用量＞反應(yīng)溫度＞料液比＞反應(yīng)時(shí)間。二次項(xiàng)A2，C2，D2差異極顯著（p＜0.01）；交互項(xiàng)AC、CD試驗(yàn)結(jié)果對乳酸鈣產(chǎn)量的影響顯著（p＜0.05）。

根據(jù)回歸模型得出AB，AC，CD，即乳酸用量與料液比、乳酸用量與反應(yīng)溫度、反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間之間交互作用得出的響應(yīng)面和等高線。

乳酸用量與料液比交互作用對乳酸鈣產(chǎn)量的影響見圖5，乳酸用量與反應(yīng)溫度交互作用對乳酸鈣產(chǎn)量的影響見圖6，反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間交互作用對乳酸鈣產(chǎn)量的影響見圖7。

圖5 乳酸用量與料液比交互作用對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

圖6 乳酸用量與反應(yīng)溫度交互作用對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

圖7 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間交互作用對乳酸鈣產(chǎn)量的影響

圖5 、圖6、圖7 中3D 響應(yīng)面圖可直觀描繪回歸模型；等高線圖形狀越趨于圓形，表明2 個(gè)自變量間的交互效應(yīng)越弱，若等高線的形狀接近橢圓形，表明2 個(gè)自變量間交互作用較強(qiáng)。相對而言，試驗(yàn)中乳酸用量（A） 與反應(yīng)溫度（C）、反應(yīng)溫度（C）與反應(yīng)時(shí)間（D） 的變化坡度較陡峭，乳酸用量（A）與料液比（B） 的變化坡度較為平緩，說明乳酸用量（A） 與反應(yīng)溫度（C）、反應(yīng)溫度（C） 與反應(yīng)時(shí)間（D） 對乳酸鈣產(chǎn)量的影響較大， （A） 乳酸用量與（B） 料液比對乳酸鈣產(chǎn)量的影響較小。

由回歸模型預(yù)測和分析得出蛋殼制備乳酸鈣的最佳工藝參數(shù)為蛋殼粉3 g 時(shí)，乳酸用量6.52 mL，料液比1∶14.95，反應(yīng)溫度46.51 ℃，反應(yīng)時(shí)間94.67 min，乳酸鈣的產(chǎn)量最高可達(dá)5.281 62 g。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮到實(shí)際情況，選擇料液比乳酸用量為7 mL，料液比1∶15，反應(yīng)溫度47 ℃，反應(yīng)時(shí)間95 min，在此條件下，乳酸鈣產(chǎn)量5.35 g 與理論值5.281 62 g接近，相對誤差僅為1.32%（＜5%），說明采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到的工藝參數(shù)真實(shí)可信，有較好的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

以雞蛋殼為原料，采用直接中和法制備乳酸鈣。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件，以乳酸鈣產(chǎn)量為指標(biāo)，得到蛋殼制備乳酸鈣的最佳工藝條件為蛋殼粉3 g 時(shí)，乳酸用量7 mL，料液比1∶15，反應(yīng)溫度47 ℃，反應(yīng)時(shí)間95 min，在最佳制備條件下乳酸鈣的產(chǎn)量最高為5.35 g，為雞蛋殼綜合利用提供技術(shù)支撐。