王芳 胡潔瓊 馮彥虎 何東

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化科，蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730030）

胃癌（gastric cancer，GC）是世界上癌癥死亡的主要原因，近年來其發(fā)病率急劇升高［1］。盡管GC患者的管理和治療有所改善，但總體五年生存率仍然較低［2］。因此仍需開發(fā)更安全的新型藥物以提高患者生存質(zhì)量并改善患者預(yù)后。烏司他?。║linastatin，UTI）在抑制腫瘤進(jìn)展方面具有突出作用，能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］。此外，研究發(fā)現(xiàn)UTI可抑制前列腺癌、GC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，但其對GC細(xì)胞惡性行為的影響仍需進(jìn)一步研究［4-5］。C-C趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）通過參與腫瘤免疫耐受調(diào)節(jié)誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長與存活、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［6］。CCL2與C-C趨化因子受體2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR2）相互作用，通過募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）促進(jìn)程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)免疫逃逸，從而促進(jìn)食管癌的發(fā)生［7］。但UTI通過調(diào)節(jié)CCL2-CCR2信號軸對GC細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和免疫逃逸的影響尚不明確。因此本實驗旨在探討UTI對GC細(xì)胞EMT和免疫逃逸的影響及其作用機(jī)制，以期為臨床治療GC提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集和細(xì)胞來源 收集2021年3月至2022年12月期間于蘭州大學(xué)第二醫(yī)院首次確診為GC的患者癌組織及癌旁組織（距離癌組織5 cm），共40對。樣本存入凍存管置于超低溫冰箱中凍存。所有患者均未接受化療或放療等形式的治療。本研究獲得蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。人胃黏膜細(xì)胞GES-1及人GC細(xì)胞系MGC803、AGS、HGC27、BGC-823、SGC-7901購于美國ATCC。

1.1.2 主要試劑與儀器 烏司他?。≒RO-321）購于艾美捷科技有限公司；MTT試劑盒（M1020）、蛋白提取試劑盒（BC3790-50T）、RNA提取試劑盒（R1200）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RP1105）、實時熒光定量PCR試劑盒（T2210）購于北京Solarbio；DEAE-Dextran細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒（HB20232yy）購于上?；钌锟萍加邢薰?；CCL2過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-CCL2）及對照（pcDNA3.1）和CCL2、CCR2引物購于廣州RiboBio；干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ，IBE10033）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2，IBE10055）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，IB-E10131） ELISA試劑盒購于江西艾博因生物科技有限公司；兔源一抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2，ab37150）、PD-L1（ab239749）、CCL2（ab214819）、CCR2（ab223366）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin，ab308347）、波形蛋白（Vimentin，ab137321）、GAPDH（ab9485）及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（ab6721）購于美國Abcam公司；多功能酶標(biāo)儀（LD-96A）購于山東萊恩德智能科技有限公司；離心機(jī)（5424）購于艾本德中國有限公司；實時熒光定量PCR儀（CFX96 Touch）購于上海艾研生物科技有限公司；光學(xué)顯微鏡（CX31）購于日本奧林巴斯公司；流式細(xì)胞儀（NOVOCYTE3130）購于美國艾森公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測CCL2、CCR2表達(dá) Trizol試劑提取組織和細(xì)胞的總RNA。以RNA為模板合成cDNA后，再以cDNA為模板設(shè)置qRT-PCR反應(yīng)體系。CCL2-F：5'-TCATAGCTACCACCATCAGTCCTCAG-3'和CCL2-R：5'-CTGGCTGCTTGTGATTCTCCTGTAG-3'；CCR2-F：5'-CGCTTCGGCAGCATTACT-3'和CCR2-R：5'-GTCGAGATGGGATACCCTT-3'；GAPDHF：5'-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3'和GAPDHR：5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3'；以2-ΔΔCt法計算組織和細(xì)胞中CCL2、CCR2的相對表達(dá)量。

1.2.2 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖［4］將AGS細(xì)胞以1×104個/孔接種至96孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，加入含0、100、200、400、800 U/ml UTI的培養(yǎng)液48 h后，以20 μl/孔加入MTT溶液，再培養(yǎng)4 h后，加入二甲基亞砜（150 μl/孔），充分振蕩后，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔的吸光度（A490）值，計算細(xì)胞增殖抑制率（%）。

1.2.3 細(xì)胞干預(yù)與分組 將AGS細(xì)胞分為control組（正常培養(yǎng)）、UTI組（400 U/ml）、pcDNA組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+UTI干預(yù)）、pcDNA-CCL2組（轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-CCL2+UTI干預(yù)），使用轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照1.2.1中qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后各組CCL2、CCR2表達(dá)。除control外，其余各組均采用400 U/ml UTI進(jìn)行干預(yù)48 h。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測 各組AGS細(xì)胞按照800～1 000個細(xì)胞接種于6孔板，連續(xù)培養(yǎng)14 d，固定后用0.5%結(jié)晶紫溶液染色觀察集落形成數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞遷移與侵襲實驗 各組AGS細(xì)胞生長至對數(shù)期時，使用涂有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室進(jìn)行侵襲實驗；遷移實驗未涂Matrigel基質(zhì)膠。各組取200 μl（2×105個）細(xì)胞懸液加入上室，下室加入600 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，固定染色，顯微鏡下隨機(jī)選取6個視野計算遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 IFN-γ、IL-2、TNF-α水平檢測 使用Ficoll試劑盒從健康志愿者全血中分離和純化人類外周血單核細(xì)胞，再用流式細(xì)胞儀從外周血單核細(xì)胞中分離出CD8+T細(xì)胞。將CD8+T細(xì)胞分為T細(xì)胞組（CD8+T細(xì)胞）、共培養(yǎng)組（AGS和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)）、UTI組（AGS和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)+400 U/ml UTI）、pcDNA組（轉(zhuǎn)染pcDNA后，AGS和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)+400 U/ml UTI）、pcDNA-CCL2組（轉(zhuǎn)染pc-DNA-CCL2后，AGS和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)+400 U/ml UTI），通過Transwell小室將AGS細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測CD8+T細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢驗 收集各組細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌2次，添加100 μl結(jié)合緩沖液懸浮各組細(xì)胞，再分別添加Annexin V-FITC和PI染液5 μl，混勻后避光染色15 min，離心棄上清，加入0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.8 MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白檢測 采用Western blot檢測蛋白表達(dá)，MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2及GAPDH一抗按照1∶1 500稀釋，HRP標(biāo)記的二抗按照1∶1 000稀釋，實驗結(jié)束后，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件分析各蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以xˉ±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCL2、CCR2在組織和細(xì)胞中的表達(dá) 與癌旁組織比較，GC癌組織中CCL2、CCR2蛋白及mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖1、表1；與GES-1細(xì)胞比較，MGC803、AGS、HGC27、BGC-823、SGC-7901細(xì)胞中CCL2、CCR2蛋白及mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），且AGS細(xì)胞中CCL2、CCR2蛋白及mRNA表達(dá)水平最高，因此，選擇AGS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗，見圖2、表2。

表1 CCL2、CCR2在組織中的表達(dá)（±s，n=40）Tab.1 Expressions of CCL2 and CCR2 in tissues （±s，n=40）

表1 CCL2、CCR2在組織中的表達(dá)（±s，n=40）Tab.1 Expressions of CCL2 and CCR2 in tissues （±s，n=40）

Note：Compared with adjacent tissues， 1）P＜0.05.

Groups CCL2/GAPDH CCR2/GAPDH CCL2 mRNA CCR2 mRNA Adjacent tissues GC cancer tissue 0.18±0.04 0.36±0.05 1.01±0.01 1.00±0.00 1.35±0.101）1.49±0.131）1.52±0.081）1.39±0.091）

表2 CCL2、CCR2在細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=6）Tab.2 Expressions of CCL2 and CCR2 in cells （±s，n=6）

表2 CCL2、CCR2在細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=6）Tab.2 Expressions of CCL2 and CCR2 in cells （±s，n=6）

Note：Comparison with GES-1 cells， 1）P＜0.05.

Groups CCL2 mRNA CCR2 mRNA 1.00±0.00 1.51±0.141）2.39±0.211）1.49±0.161）1.84±0.121）1.94±0.151）GES-1 MGC803 AGS HGC27 BGC-823 SGC-7901 CCL2/GAPDH 0.21±0.04 1.28±0.091）1.89±0.131）1.31±0.111）1.49±0.131）1.62±0.151）CCR2/GAPDH 0.36±0.06 1.25±0.101）1.74±0.121）1.36±0.141）1.43±0.121）1.58±0.131）1.00±0.00 1.45±0.131）2.46±0.171）1.53±0.141）1.96±0.151）2.13±0.181）

圖1 Western blot檢測組織中CCL2、CCR2蛋白表達(dá)Fig.1 Western blot analysis of CCL2 and CCR2 protein expressions in tissues

圖2 Western blot檢測細(xì)胞中CCL2、CCR2蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot analysis of CCL2 and CCR2 protein expressions in cells

2.2 UTI對AGS細(xì)胞的增殖抑制情況 與0 U/ml比較，AGS細(xì)胞的增殖抑制率在100、200、400、800 U/ml UTI干預(yù)下以劑量依賴性方式顯著升高（P＜0.05），IC50=469.894 U/ml，本研究選取400 U/ml UTI進(jìn)行后續(xù)實驗，見表3。

表3 不同濃度UTI對AGS細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，n=6）Tab.3 Proliferation inhibition rate of AGS cells by different concentrations of UTI （±s，n=6）

表3 不同濃度UTI對AGS細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，n=6）Tab.3 Proliferation inhibition rate of AGS cells by different concentrations of UTI （±s，n=6）

Note：Compared with 0 U/ml UTI group，1）P＜0.05； compared with 100 U/ml UTI group，2）P＜0.05； compared with 200 U/ml UTI group，3）P＜0.05； compared with 400 U/ml UTI group， 4）P＜0.05.

Proliferation inhibition rate/%0 9.35±1.421）22.57±2.691）2）41.26±2.731）2）3）68.14±3.281）2）3）4）469.894 U/ml Groups 0 U/ml 100 U/ml 200 U/ml 400 U/ml 800 U/ml IC50

2.3 UTI對AGS細(xì)胞中CCL2、CCR2 mRNA表達(dá)的影響 與control組比較，UTI組AGS細(xì)胞中CCL2、CCR2 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與pcDNA組比較，pcDNA-CCL2組AGS細(xì)胞中CCL2、CCR2 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），提示pcDNA-CCL2轉(zhuǎn)染成功，見表4。

表4 各組AGS細(xì)胞中CCL2、CCR2 mRNA表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.4 Comparison of CCL2 and CCR2 mRNA expressions in AGS cells in each group （±s，n=6）

表4 各組AGS細(xì)胞中CCL2、CCR2 mRNA表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.4 Comparison of CCL2 and CCR2 mRNA expressions in AGS cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with pcDNA group， 2）P＜0.05.

CCR2 mRNA 1.00±0.02 0.31±0.051）0.34±0.06 1.19±0.112）Groups Control UTI pcDNA pcDNA-CCL2 CCL2 mRNA 1.00±0.03 0.24±0.041）0.26±0.05 1.25±0.102）

2.4 UTI對AGS細(xì)胞增殖能力的影響 與control組比較，UTI組AGS細(xì)胞集落形成數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與pcDNA組比較，pcDNA-CCL2組AGS細(xì)胞集落形成數(shù)顯著增多（P＜0.05），見圖3、表5。

表5 各組AGS集落形成數(shù)比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of AGS colony formation in each group （±s，n=6）

表5 各組AGS集落形成數(shù)比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of AGS colony formation in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with pcDNA group， 2）P＜0.05.

Number of colony formation 176.39±6.72 62.28±4.251）65.47±4.31 134.19±5.322）Groups Control UTI pcDNA pcDNA-CCL2

圖3 各組細(xì)胞集落形成數(shù)比較Fig.3 Comparison of cell colony formation in each group

2.5 UTI對AGS細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響 與control組比較，UTI組AGS細(xì)胞遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與pcDNA組比較，pcDNA-CCL2組AGS細(xì)胞遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.05），見圖4、表6。

表6 各組AGS細(xì)胞遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)比較（±s，n=6）Tab.6 Comparison of migration and invasion of AGS cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with pcDNA group， 2）P＜0.05.

Groups Invasive cell counts 128.49±5.68 46.28±3.261）44.37±3.49 99.05±4.622）Control UTI pcDNA pcDNA-CCL2 Number of migrating cells 159.38±6.23 62.34±4.391）61.07±4.25 127.45±5.212）

2.6 UTI對免疫細(xì)胞及免疫因子的影響 與T細(xì)胞組比較，共培養(yǎng)組CD8+T細(xì)胞IFN-γ、IL-2、TNF-α水平降低，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與共培養(yǎng)組比較，UTI組CD8+T細(xì)胞IFN-γ、IL-2、TNF-α水平升高，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與pcDNA組比較，pcDNA-CCL2組CD8+T細(xì)胞IFN-γ、IL-2、TNF-α水平降低，細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05），見圖5、表7。

表7 各組CD8+T細(xì)胞凋亡和IFN-γ、IL-2、TNF-α水平比較（±s，n=6）Tab.7 Comparison of CD8+T cell apoptosis and IFN-γ，IL-2， TNF-α levels in each group （±s，n=6）

Note：Compared with T cell group， 1）P＜0.05； compared with co-culture group， 2）P＜0.05； compared with pcDNA group， 3）P＜0.05.

TNF-α/（ng·L-1）56.37±4.23 31.92±2.651）48.21±3.412）47.29±3.25 25.68±2.743）Groups T cell Co-culture UTI pcDNA pcDNACCL2 Apoptosis/%6.37±1.09 24.18±2.151）15.35±1.232）15.47±1.28 21.70±1.493）IFN-γ/（ng·L-1）42.73±3.15 25.96±2.311）37.68±2.422）38.32±2.46 20.53±1.843）IL-2/（ng·L-1）50.36±4.02 28.75±2.491）45.19±3.212）44.82±3.16 23.58±1.743）

2.7 UTI對MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)的影響 與control組比較，UTI組AGS細(xì)胞中MMP-2、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與pcDNA組比較，pcDNACCL2組AGS細(xì)胞中MMP-2、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)水平升高，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表8、圖6。

表8 各組AGS細(xì)胞中MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.8 Comparison of MMP-2， E-cadherin， Vimentin， PD-L1， CCL2 and CCR2 protein expressions in AGS cells of each group （±s，n=6）

表8 各組AGS細(xì)胞中MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.8 Comparison of MMP-2， E-cadherin， Vimentin， PD-L1， CCL2 and CCR2 protein expressions in AGS cells of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with pcDNA， 2）P＜0.05.

CCR2 1.74±0.12 0.51±0.041）0.47±0.05 1.28±0.102）Groups Control UTI pcDNA pcDNA-CCL2 MMP-2 1.72±0.13 0.54±0.081）0.56±0.06 1.37±0.112）E-cadherin 0.28±0.05 1.25±0.101）1.21±0.08 0.43±0.062）Vimentin 1.31±0.12 0.27±0.051）0.34±0.07 1.04±0.102）PD-L1 1.29±0.10 0.18±0.031）0.23±0.04 0.96±0.082）CCL2 1.89±0.13 0.46±0.071）0.53±0.08 1.32±0.112）

圖6 Western blot檢測細(xì)胞中MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)Fig.6 Western blot detects protein expressions of MMP-2，E-cadherin，Vimentin，PD-L1，CCL2 and CCR2 in cells

3 討論

GC是常見的胃腸道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅患者的生命健康［8-9］。盡管GC的手術(shù)和輔助治療方面取得了巨大進(jìn)展，但由于轉(zhuǎn)移會導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)，GC患者的五年生存率較低［10］。因此，闡明GC轉(zhuǎn)移所涉及的分子機(jī)制對于改善生存結(jié)局具有重要意義。

UTI在臨床上主要用于急性胰腺炎或慢性復(fù)發(fā)性胰腺炎的治療，近年研究發(fā)現(xiàn)，UTI在體內(nèi)和體外均具有良好的抗腫瘤活性，其通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］。UTI通過下調(diào)尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）表達(dá)抑制高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM的轉(zhuǎn)移和侵襲［11］。UTI能夠明顯抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖和遷移，提示UTI可能是治療胃癌的潛在策略［5］。SHEN等［12］發(fā)現(xiàn)UTI通過調(diào)節(jié)MMP-9和E-cadherin表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，與姜黃素合用時效果更明顯。EMT是細(xì)胞由上皮狀態(tài)向間質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變，并使其獲得遷移和侵襲行為的生物學(xué)過程，EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移、器官分化等多種生物學(xué)行為中扮演重要角色［13］。E-cadherin是維持上皮細(xì)胞極性的基因，在EMT發(fā)生過程中下調(diào)表達(dá)，間充質(zhì)標(biāo)記物如N-鈣黏蛋白、Vimentin在EMT發(fā)生過程中上調(diào)表達(dá)。研究表明，EMT是GC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要步驟，與GC患者預(yù)后不良密切相關(guān)［14］。本研究中，UTI顯著降低AGS細(xì)胞的集落形成數(shù)、遷移與侵襲數(shù)、MMP-2、Vimentin蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Ecadherin蛋白表達(dá)。提示UTI在體外可抑制AGS細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及EMT，UTI具有抗GC作用。

近年來，越來越多的證據(jù)表明腫瘤細(xì)胞具有抑制腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-2和IFN-γ能力，從而有利于腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞的免疫檢查，免疫逃逸對腫瘤的存活和發(fā)展至關(guān)重要［15］。據(jù)報道，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞可以募集免疫抑制細(xì)胞，如CD4+T細(xì)胞，以破壞CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能［16］。此外，PD-L1是B7家族配體，可與其受體程序性死亡蛋白-1（PD-1）結(jié)合，影響腫瘤特異性T細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制CD8+T細(xì)胞活性，導(dǎo)致腫瘤中的免疫逃逸。臨床上，大量研究表明，采用抗PD-1抗體阻斷PD-1檢查點是不同癌癥的有效免疫治療方法［17］。研究發(fā)現(xiàn)，UTI具有免疫調(diào)節(jié)作用，可顯著增加食管癌手術(shù)患者中免疫相關(guān)細(xì)胞因子（NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及活化的T細(xì)胞亞群）水平，增強(qiáng)患者免疫功能［18］。不同劑量的UTI對腹腔鏡結(jié)直腸癌手術(shù)患者的細(xì)胞免疫具有一定影響［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，UTI能提高CD8+T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、IL-2、TNF-α水平，降低CD8+T細(xì)胞凋亡率及AGS細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)。提示UTI通過提高免疫因子水平，抑制免疫細(xì)胞凋亡和免疫逃逸，抑制AGS細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及EMT，從而發(fā)揮抗GC作用。

CCL2是免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)因子，CCL2-CCR2通路激活可抑制免疫細(xì)胞活化，有利于惡性腫瘤發(fā)展［20］。研究表明，在肝細(xì)胞癌中，阻斷CCL2-CCR2信號通過激活T細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)抑制小鼠肝腫瘤生長，抑制癌細(xì)胞的惡性生長和轉(zhuǎn)移，減少術(shù)后復(fù)發(fā)，提高生存率［21］。CCL2-CCR2通路的激活可促進(jìn)順鉑耐藥GC細(xì)胞的EMT和腫瘤血管生成［22］。CCL2-CCR2的激活與巨噬細(xì)胞的浸潤極化有關(guān)，M2極化增加了巨噬細(xì)胞中PD-L2的表達(dá)，導(dǎo)致食管癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，進(jìn)而促進(jìn)食管癌的發(fā)生發(fā)展［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，UTI能抑制CCL2、CCR2 mRNA及蛋白表達(dá)，且過表達(dá)CCL2后，提高了CCL2、CCR2 mRNA表達(dá)及免疫因子水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡，從而減弱了UTI對AGS細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT的抑制作用。提示UTI可能通過抑制CCL2-CCR2信號通路抑制AGS細(xì)胞的EMT和免疫逃逸。

綜上所述，UTI可能通過抑制CCL2-CCR2信號通路抑制AGS細(xì)胞的EMT和免疫逃逸。為治療GC提供了新的藥物及靶點參考，但本研究尚存在不足之處：UTI對其他靶點及通路研究仍有待闡明。課題組將在后續(xù)實驗中進(jìn)一步明確UTI對GC的作用。