劉佳敏 張自力 曾蓉 徐旭 楊艷紅 彭彬 戢敏 潘萬龍

（1.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)研究所，南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院電子顯微鏡結(jié)構(gòu)研究單位，南充 637000；3.簡陽市人民醫(yī)院，成都 641400）

小細(xì)胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）作為細(xì)胞間通訊的重要橋梁，由脂質(zhì)雙分子層組成，內(nèi)、外層膜在磷脂組成方面無明顯差異，包含與本源細(xì)胞相同的內(nèi)容物，如：DNA，核酸，蛋白質(zhì)等。sEVs因其結(jié)構(gòu)特異性而具有抗降解能力，在體液中可以保護(hù)包裹的物質(zhì)不易被破壞，從而能夠更好地促進(jìn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和調(diào)控［1］。大多數(shù)用于分離外泌體的方法也是共同分離不同生物源性的EVs異質(zhì)群體的方法，所以2018年國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）重新定義了胞外囊泡。將直徑小于200 nm的EVs定義為小EVs，大于或等于200 nm為大或中EVs［2-3］。近年來，細(xì)胞外囊泡因其特異性的結(jié)構(gòu)和功能逐漸引起研究者廣泛的關(guān)注和興趣，特別是在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）研究方面［4］。

乙型肝炎是世界傳染性疾病之一。全球有2.96億人是慢性HBV攜帶者，約有100萬攜帶者死于HBV嚴(yán)重并發(fā)癥［5］。近年來，盡管乙型肝炎通過疫苗預(yù)防有效降低了新發(fā)疾病數(shù)量，但仍存在5%疫苗無應(yīng)答個體，加之感染人群基數(shù)巨大，因此，診斷和治療HBV感染仍是亟待解決的問題［6］。人體一旦感染HBV，HBV可能持續(xù)存在［7］。治愈乙型肝炎患者的基礎(chǔ)在于充分掌握HBV復(fù)制調(diào)控的分子機(jī)制，HBV主要與肝細(xì)胞膜表面的肝膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）或硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行復(fù)制傳播［8-9］，但近期發(fā)現(xiàn)這并不是HBV傳染的唯一途徑。據(jù)文獻(xiàn)報道，除了受體途徑以外，sEVs可以介導(dǎo)HBV傳播未感染的肝細(xì)胞［10］。HBV與sEVs之間相互作用尚未被充分了解，因此迫切需要在這一領(lǐng)域進(jìn)行進(jìn)一步的研究，本文主要綜述sEVs與HBV傳遞的關(guān)系及sEVs介導(dǎo)HBV感染的分子機(jī)制，為研究HBV持續(xù)感染提供新的視角。

1 HBV的生命周期

HBV是一種小包膜DNA病毒，通過吸附表面受體進(jìn)入胞內(nèi)釋放核衣殼，松弛環(huán)狀雙鏈DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）穿梭到核內(nèi)并轉(zhuǎn)化為共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），轉(zhuǎn)錄病毒RNA并出核翻譯，裝載前基因組RNA（pregenomic RNA，PgRNA）和病毒聚合酶形成新的核衣殼，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生成熟的病毒粒子［11-12］。而聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）-高爾基體（Golgi）中間隔室的HBV，一旦與核衣殼接觸，便會觸發(fā)包膜蛋白在MVB膜中形成緊密的排列，隨后驅(qū)動向內(nèi)出芽，產(chǎn)生完整的包膜病毒粒子。在HBV包膜病毒粒子的產(chǎn)生的過程中需要一種E類蛋白AIP1/Alix，這類蛋白是多泡體（multivesicular bodies，MVB）依賴病毒粒子的結(jié)合伙伴，與內(nèi)吞體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）成分相互作用，從而可以催化MVB囊泡萌發(fā)的下游機(jī)制，并促進(jìn)MVB的分選和囊泡的形成［13-14］。然而，ESCRT不僅是HBV病毒粒子包膜產(chǎn)生的重要成分，同時也是sEVs驅(qū)動、分選、膜形成和脫落的重要因子［15-16］。另外，sEVs中含有高水平的補體抑制蛋白（CD55，CD59），可以保護(hù)顆粒免受IG介導(dǎo)的補體招募和裂解的破壞，并且廣泛的包膜病毒（即HIV-1，HBV等）能夠挾持并利用ESCRT復(fù)合物從質(zhì)膜上發(fā)芽［17］。而從質(zhì)膜發(fā)芽的病毒粒子可通過網(wǎng)狀蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（clathrinmediated endocytosis，CME）和持續(xù)大量的胞吞作用介導(dǎo)病毒感染，這些途徑均可以允許sEVs進(jìn)入。在sEVs內(nèi)化后，可依靠脂質(zhì)溶酶雙磷脂酸（lysobisphosphatidic acid，LBPA），一種能使病毒穿透sEVs密切相關(guān)的離子，促進(jìn)晚期內(nèi)小體/多囊泡小體（LES/MVB）的sEVs的膜融合和伴隨的內(nèi)容物脫落［18］。新近研究表明，在慢性乙型肝炎患者中，從血清分離出來的純化的sEVs含有rcDNA和cccDNA等核酸物質(zhì)［19］。

以上研究表明，HBV病毒粒子的產(chǎn)生需要利用ESCRT復(fù)合物和MVB，sEVs可能通過MVBs與質(zhì)膜融合使攜帶HBV病毒粒子從質(zhì)膜上脫落，從而分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中。隨后通過內(nèi)吞途徑胞吞sEVs，sEVs所包裹的DNA可脫落進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步完成病毒的周期循環(huán)。

2 HBV感染中sEVs的作用

sEVs作為細(xì)胞間生物活性分子運輸?shù)妮d體，其功能不僅取決于來源細(xì)胞，也依賴于其包裹內(nèi)含物，sEVs中包含與HBV相關(guān)物質(zhì)，如HBV DNA，編碼和非編碼RNA，蛋白質(zhì)甚至相關(guān)的線粒體DNA，它們因脂質(zhì)雙分子的保護(hù)從而避免了降解，sEVs可作為細(xì)胞間的傳播者，促進(jìn)內(nèi)容物在體外和體內(nèi)的直接轉(zhuǎn)移［20］。

2.1 HBV挾持sEVs進(jìn)行傳播 在HBV感染性疾病當(dāng)中，除了受體途徑之外，sEVs可作為HBV DNA的強(qiáng)大載體，將它們從受感染細(xì)胞運送到未受感染細(xì)胞，以促進(jìn)HBV的傳播［21-22］。有研究證明，慢性乙型肝炎患者血清中的sEVs能誘導(dǎo)內(nèi)含物HBV DNA在幼稚的人肝細(xì)胞中活動性感染，進(jìn)而促進(jìn)病毒的轉(zhuǎn)移［19，23］。sEVs生物發(fā)生的過程中有一種關(guān)鍵的酶即中性鞘磷脂酶2（neutral sphingomyelinase 2，nSmnase2），乙型肝炎x抗原（hepatitis B x antigen，HBx）可以通過誘導(dǎo)nSmase2的活性來增加sEVs的產(chǎn)生［24］。中性Ⅱ型鞘磷脂酶產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺參與sEVs的生物發(fā)生，介導(dǎo)膜亞結(jié)構(gòu)域的形成，誘導(dǎo)MVBs膜向內(nèi)出芽，并觸發(fā)產(chǎn)生含有HBV DNA的sEVs，傳遞給未感染的肝細(xì)胞［25-26］。另外，sEVs除了可以介導(dǎo)HBV感染細(xì)胞DNA的傳播之外，它還可以介導(dǎo)線粒體DNA（mtDNA）激活A(yù)TM-Chk2（共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變激酶及下游靶基因Chk2）信號通路，從而預(yù)防HBV相關(guān)的肝?。?7］。

這些研究表明，在HBV感染中，HBV可挾持sEVs，在細(xì)胞間傳遞HBV DNA給未受感染的細(xì)胞介導(dǎo)病毒的傳播，同時還可以介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)DNA預(yù)防疾病的發(fā)生。

2.2 sEVs攜帶核酸對HBV感染的影響 sEVs中富集大量的編碼和非編碼RNA并可將它們運輸?shù)绞荏w細(xì)胞，執(zhí)行各種生理功能，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，尤其是在病理情況下的調(diào)控更為顯著［28］。在病毒感染過程中，sEVs攜帶的肝炎病毒因其分泌及組成受病毒感染的影響，除了可以擴(kuò)大肝炎病毒的傳播范圍外，還可以攜帶大量的病毒抗原顆粒促進(jìn)疾病發(fā)生［29］。在HBV感染的患者中，HBx蛋白存在時可以調(diào)節(jié)sEVs的生物發(fā)生機(jī)制，這些囊泡特異性地包裹HBx mRNA和蛋白，并在細(xì)胞外環(huán)境中脫落，從而影響內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［24］。同時，感染也會增加肝細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，sEVs可攜帶miR-21下調(diào)IL-12的表達(dá)從而抑制NK細(xì)胞的活性［30］。然而，這些復(fù)雜的囊泡物質(zhì)賦予了sEVs在機(jī)體正常和病理環(huán)境調(diào)節(jié)過程中具有相互矛盾的關(guān)系，其不僅能介導(dǎo)病毒的傳播，還具有抵抗病毒的表現(xiàn)。

HBV-miR-3可通過sEVs和HBV病毒粒子釋放到循環(huán)中，sEVs穿梭HBV-miR-3靶向HBV轉(zhuǎn)錄本的特定位點，特異性地降低HBc蛋白表達(dá)、PgRNA水平和HBV復(fù)制中間產(chǎn)物（HBV-RI）的生成，從而抑制HBV病毒粒子的復(fù)制［31-32］。進(jìn)一步，sEVs釋放的HBV-miR-3可刺激巨噬細(xì)胞M1極化，使細(xì)胞因子信號抑制因子5表達(dá)缺失從而激活JAK/STAT通路增強(qiáng)IFN誘導(dǎo)的抗HBV作用［33-34］。由此可見，sEVs中的HBV-miR-3通過減少肝細(xì)胞損傷，有助于治療HBV持續(xù)感染患者的發(fā)展。

這些研究表明，在HBV感染中sEVs具有穿梭編碼和非編碼RNA和相關(guān)蛋白質(zhì)的功能，這些活性分子物質(zhì)不僅會促進(jìn)病毒復(fù)制，同時也具有矛盾的另一面，抵抗病毒的增加。了解HBV相關(guān)sEVs包含的這些生物活性的核酸，將有助于研究HBV引起慢性感染的過程。

2.3 sEVs內(nèi)含物蛋白質(zhì)對HBV感染的影響 在HBV感染狀態(tài)下，HBV抗原激發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)成分和相關(guān)因子的產(chǎn)生，它們是一類具有廣泛生物學(xué)活性的分子蛋白質(zhì)，sEVs則是它們的關(guān)鍵傳播者。例如：sEVs可通過激活模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），如Toll樣受體3（Toll-like receptors 3，TLR3），從而增強(qiáng)T細(xì)胞活性產(chǎn)生IL-17A而加劇肝臟疾病的發(fā)展，致肝星狀細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)激活啟動纖維化階段［35-36］。sEVs介導(dǎo)的IFN誘導(dǎo)的跨膜蛋白2，一種作用于Ⅰ型IFN信號的上游的負(fù)調(diào)控因子，從肝細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞的運輸增強(qiáng)了IFITM2對內(nèi)源性IFN-α合成的抑制作用，從而阻斷了外源性干擾素的抗乙型肝炎病毒的療效［37］。然而，在肝非實質(zhì)細(xì)胞中，IFN-α誘導(dǎo)的sEVs卻富含具有抗病毒活性的分子，這些活性物質(zhì)被肝細(xì)胞所內(nèi)化后可以使機(jī)體抵御HBV病毒的入侵［38］。

這些研究表明，sEVs具有豐富的蛋白質(zhì)成分，無論是大分子蛋白質(zhì)如TLR3，還是小分子蛋白質(zhì)如IFN-α等，在HBV感染的過程中sEVs攜帶的蛋白質(zhì)對細(xì)胞均具有一定的調(diào)控作用，這種調(diào)控作用具有雙向性，既可以促進(jìn)疾病的發(fā)生，也可以防止病毒的入侵。

3 sEVs在HBV感染中的臨床潛在應(yīng)用

在HBV感染中，sEVs是極其復(fù)雜的獨立結(jié)構(gòu)，其所攜帶的物質(zhì)會促進(jìn)病毒適應(yīng)動態(tài)的微環(huán)境變化，導(dǎo)致HBV感染過程中促炎和抗炎作用的失衡，從而造成機(jī)體的損傷或抗病毒反應(yīng)。同時sEVs也可成為檢測疾病的診斷和治療方法。

3.1 sEVs可作為HBV感染的生物標(biāo)志物 HBV感染與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)，雖然現(xiàn)在有很多檢測肝炎及相關(guān)并發(fā)癥的診斷方法，但對于它們的早期診斷卻不具有準(zhǔn)確性。臨床上現(xiàn)有的生化標(biāo)志物存在一定的局限性，且不能準(zhǔn)確反映肝炎情況。sEVs由于具有穩(wěn)定性、可用性以及在體液中廣泛分布等優(yōu)勢，在肝炎疾病的輔助診斷中具有重要價值，并可能成為診斷不同嚴(yán)重程度的乙型肝炎的新生物標(biāo)志物［39］。有研究表明，sEVs所攜帶的mi-RNA，如miR-122和miR-151，比ALT能更穩(wěn)定和敏感地反映肝臟炎癥活動［40］。在90%以上感染HBV的肝癌患者中，發(fā)現(xiàn)血清中sEVs攜帶的miR-21和miR-17-5p等具有高度的敏感性和特異性，sEVs攜帶的miR-21標(biāo)記效果要比血清miR-21更好［41-42］。此外，sEVs所攜帶的lncRNAs在HBV感染中也起著重要作用，如HAR1A、HAR1B和HOTAIR表達(dá)的變化可能表明它們通過CoREST/REST復(fù)合物參與了HBV基因的表觀遺傳抑制，在感染的預(yù)后中起重要作用，循環(huán)HOTTIP在HBV患者中表達(dá)增加，可作為一種治療和鑒定因子［43-44］。

雖然已有大量研究證實sEVs可作為HBV感染的輔助診斷工具，但其不確定性也有很多，例如sEVs的儲存困難，HCC患者的血清中也上調(diào)miR-122生物標(biāo)志物，lncRNA的HOTAIR因子可促進(jìn)胃癌的發(fā)生，進(jìn)一步表明sEVs的miRNA和lncRNA缺乏一定的特異性［45-46］。盡管如此，sEVs在HBV感染中的價值是我們不可忽視的，闡明sEVs中miRNA和lncRNA與HBV之間的關(guān)系，將有助于我們了解HBV感染。

3.2 sEVs可作為HBV感染的新的治療方法 目前只有核苷酸類似物和PEG-IFN這兩種HBV治療方法，但易造成耐藥性和HBV反彈［47-48］。sEVs由于其自身的特異性結(jié)構(gòu)和屬性，可作為納米穿孔技術(shù)的研究用于治療性蛋白質(zhì)和抗病毒藥物的載體［49-51］。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)有一種未經(jīng)修飾的sEVs作為重組HBV抗原佐劑的疫苗可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而提高IFN-γ的水平，CD4+T細(xì)胞釋放的sEVs可以活化B細(xì)胞反應(yīng)從而提高HBsAg疫苗的療效，雖然這些研究還處于早期階段，需要進(jìn)一步的研究來確定治療靶點，但與傳統(tǒng)疫苗相比，它更容易制備和操作，同時具有一定的安全性、可用性、穩(wěn)定性和耐用性［52-54］。來自DEXs（樹突狀細(xì)胞的sEVs）制備的疫苗已應(yīng)用于Ⅰ期臨床試驗中，同時評估了其可行性和安全性［55-56］。因此表明，sEVs將來可作為針對HBV的候選疫苗。

4 討論

sEVs從代謝廢物一躍成為人們爭先恐后研究的“寵兒”，因其本身結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性和特殊性，在病理微環(huán)境，信號傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的媒介作用。隨著研究的深入，sEVs在HBV感染中作用逐漸被揭示，其不僅與HBV的感染具有密切的關(guān)系，而且是HBV生命周期的關(guān)鍵調(diào)控者。盡管在HBV感染的診斷和治療方面仍然存在很多困難，并且對HBV病毒挾持sEVs進(jìn)行傳播和調(diào)控機(jī)體的感染機(jī)制也不是完全明了，但sEVs作為HBV 感染的新生物標(biāo)志物和診療手段未來可期。深入研究這些納米級的微小顆粒物質(zhì)在HBV感染性疾病中的作用，有助于臨床上HBV感染的診斷和治愈。