賀婕 康妍 吳建楠 賀敏

（1.河北中石油中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，廊坊 065000；2.河北中石油中心醫(yī)院精神心理科，廊坊 065000）

單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）侵入顱內(nèi)是引起患者單純皰疹病毒腦炎（herpes simplex virus encephalitis，HSE）的主要原因，常表現(xiàn)為顳葉、額葉與邊緣系統(tǒng)腦組織病變，引起患者腦組織水腫、出血性壞死等［1］。HSE是一種散發(fā)、致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患者常發(fā)生精神異常、失語、偏癱等行為改變，嚴(yán)重影響患者日常生活［2］。盡管臨床已給予HSE患者充分抗病毒治療，但仍有少部分患者好轉(zhuǎn)后又繼發(fā)自身免疫性腦炎（autoimmune encephalitis，AE）。AE發(fā)病機制由自身免疫損害引起，嚴(yán)重時會導(dǎo)致患者死亡［3-4］。腦脊液中S100B蛋白是神經(jīng)元損傷標(biāo)志因子，正常濃度下具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，可促進(jìn)神經(jīng)生長和修復(fù)，濃度過高會抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。胱抑素C（cystatin C，Cys-C）可維持機體代謝，其表達(dá)異常會導(dǎo)致腎病、炎癥及心血管疾病等多種疾?。?］。基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）可降解細(xì)胞基質(zhì)鋅依賴性，在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［7］。上述指標(biāo)在評估患者病情方面具有重要意義，但關(guān)于腦脊液中S100B、Cys-C、MMP-9水平預(yù)測HSV感染患者繼發(fā)AE的研究較少。因此，本研究主要探討HSV感染后腦脊液中S100B、Cys-C、MMP-9水平對誘發(fā)AE的預(yù)測價值，以期為HSV感染患者臨床治療和預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2016年1月至2021年3月河北中石油中心醫(yī)院收治的200例HSV感染患者為研究對象，其中男118例，女82例，年齡20～71歲，平均（46.76±12.72）歲，AE患者主要癥狀為精神行為異常、認(rèn)知障礙、記憶力下降、言語障礙、運動障礙、自主神經(jīng)功能障礙等［8］。繼發(fā)AE患者自HSE確診至繼發(fā)AE平均時間為（48.12±12.86） d。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞18周歲；②腦脊液HSV抗體檢測陽性；③急性或亞急性起病，定義急性期為發(fā)病＜14 d；④腦脊液檢查顯示以淋巴細(xì)胞增多反應(yīng)為主，蛋白＞0.4 g/L，涂片或培養(yǎng)無細(xì)菌、結(jié)核菌及真菌；⑤所有患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝、腎功能不全者；②惡性腫瘤、代謝性及中毒性腦病等非中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患者；③治療依從性較差者；④不同意參加該項研究者。本研究經(jīng)河北中石油中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審批（KYLL-2022-35）。

1.2 方法

1.2.1 腦脊液S100B、Cys-C、MMP-9檢測 所有患者于入院24 h內(nèi)行腰椎穿刺收集4 ml腦脊液，室溫下3 000 r/min離心15 min，收集上清并于-80 ℃保存。檢測前將樣本從冰箱取出進(jìn)行凍融，ELISA檢測腦脊液S100B、MMP-9，免疫透射比濁法檢測Cys-C。收集所有患者入院時臨床資料，包括性別、年齡、臨床癥狀（發(fā)熱、頭痛等）、血壓、入院前病程、是否發(fā)生精神障礙、磁共振檢查（magnetic resonance imaging，MRI）檢查結(jié)果、血清白細(xì)胞計數(shù)（white blood cells count，WBC）、腦脊液壓力（cerebrospinal fluid pressure，CSFP）、腦脊液白細(xì)胞計數(shù)（white blood cells count，WBC）、腦脊液葡萄糖、腦脊液Cys-C、腦脊液S100B、腦脊液MMP-9、腦電圖（electroencephalogram，EEG）檢查結(jié)果。

1.2.2 隨訪 所有患者隨訪3個月，根據(jù)是否繼發(fā)AE分為兩組：研究組（繼發(fā)AE，35例）和對照組（未繼發(fā)AE，165例）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。Logistic回歸分析繼發(fā)AE的危險因素，曲線下面積（area under the curve，AUC）評估各指標(biāo)預(yù)測價值，Spearman法分析腦脊液中Cys-C、MMP-9與S100B水平的相關(guān)性。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組和對照組患者臨床資料對比 研究組與對照組性別、年齡、發(fā)熱占比、血壓、入院前病程、精神障礙占比、CSFP、腦脊液蛋白、腦脊液WBC及腦脊液葡萄糖差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與對照組相比，研究組頭痛占比、MRI異常占比、腦脊液S100B、MMP-9及EEG異常占比均顯著升高，腦脊液Cys-C水平顯著降低（P＜0.05，表1）。

表1 兩組患者臨床資料Tab.1 Clinical data of two groups

2.2 多因素回歸分析 以HSV感染患者是否繼發(fā)AE為因變量（發(fā)生AE=1，未發(fā)生AE=0），以單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的影響因素作為自變量，按表2進(jìn)行賦值，進(jìn)行多因素逐步Logistic回歸分析。結(jié)果顯示MRI異常、腦脊液S100B及MMP-9升高、EEG異常是HSV感染患者繼發(fā)AE的獨立危險因素，腦脊液Cys-C是其保護(hù)因素（表3）。

表2 多因素Logistic回歸分析變量賦值Tab.2 Multivariate Logistic regression analysis variable assignment description

表3 HSV感染患者繼發(fā)AE的多因素Logistic回歸分析Tab.3 Multivariate Logistic regression analysis of SECONDARY AE in patients with HSV infection

2.3 Cys-C、MMP-9與S100B的相關(guān)性分析 采用Spearman法對腦脊液中Cys-C、MMP-9與S100B水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，HSV感染患者Cys-C濃度與S100B水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.83，P＜0.05），MMP-9濃度與S100B水平呈正相關(guān)（r=0.88，P＜0.05，圖1）。

圖1 腦脊液中Cys-C、MMP-9與S100B的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of Cys-C， MMP-9 and S100B in cerebrospinal fluid

2.4 曲線擬合及閾值效應(yīng)分析

2.4.1 腦脊液Cys-C與AE發(fā)生率的曲線擬合及閾值效應(yīng)分析 進(jìn)一步探討腦脊液Cys-C與AE發(fā)生的關(guān)系，將多因素Logistic回歸分析結(jié)果中可能影響兩者的因素進(jìn)行調(diào)整并對其進(jìn)行平滑曲線擬合，結(jié)果顯示，隨著Cys-C升高，HSV感染患者繼發(fā)AE概率呈下降趨勢（圖2）。腦脊液Cys-C與AE存在閾值效應(yīng)，對其進(jìn)行閾值效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，Cys-C＜2.12 mg/L時，隨著Cys-C水平升高，HSV感染患者AE發(fā)生率呈下降趨勢（OR=0.886，95%CI：0.785～0.922，P＜0.001）；Cys-C＞2.12 mg/L時，隨著Cys-C水平升高，HSV感染患者AE發(fā)生率不受影響（OR=1.000，95%CI：0.992～1.015，P=0.736）。

圖2 Cys-C與AE發(fā)生率關(guān)系的平滑擬合曲線Fig.2 Smooth fitting curve of relationship between Cys-C and incidence of AE

2.4.2 腦脊液S100B與AE發(fā)生率的曲線擬合及閾值效應(yīng)分析 調(diào)整MRI、腦脊液Cys-C及MMP-9、EEG后，曲線擬合發(fā)現(xiàn)，隨著S100B升高，HSV感染患者發(fā)生AE概率呈上升趨勢。在曲線擬合基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行閾值效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，S100B＜1.34 μg/L時，HSV感染患者AE發(fā)生率不受影響（OR=1.000，95%CI：0.996～1.012，P=0.833）；S100B＞1.34 μg/L時，隨著S100B水平升高，HSV感染患者AE發(fā)生率呈上升趨勢（OR=0.885，95%CI：0.824～0.945，P＜0.001，圖3）。

圖3 S100B與AE發(fā)生率關(guān)系的平滑擬合曲線Fig.3 Smooth fitting curve of relationship between S100B and incidence of AE

2.4.3 腦脊液MMP-9與AE發(fā)生率的曲線擬合及閾值效應(yīng)分析 調(diào)整MRI、腦脊液Cys-C及S100B、EEG后，曲線擬合發(fā)現(xiàn)，隨著MMP-9升高，HSV感染患者發(fā)生AE概率呈上升趨勢。在曲線擬合基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行閾值效應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)MMP-9＜91.0 ng/ml時，隨著MMP-9水平升高，HSV感染患者AE發(fā)生率不受影響（OR=1.000，95%CI：0.994～1.006，P=0.795）；MMP-9＞91.0 ng/ml時，隨著MMP-9水平升高，HSV感染患者AE發(fā)生率呈上升趨勢（OR=0.962，95%CI：0.914～0.998，P＜0.001，圖4）。

圖4 MMP-9與AE發(fā)生率關(guān)系的平滑擬合曲線Fig.4 Smooth fitting curve of relationship between MMP-9 and incidence of AE

2.5 聯(lián)合預(yù)測因子的生成及ROC曲線 在Stata 10.0軟件中使用Predict pre1命令將腦脊液S100B、Cys-C、MMP-9作為協(xié)變量擬合成新生聯(lián)合預(yù)測因子pre1。取約登指數(shù)最大時pre1對應(yīng)的數(shù)值為最佳臨界值，即0.418。以腦脊液S100B、Cys-C、MMP-9及三者聯(lián)合預(yù)測為變量，AE發(fā)生情況為狀態(tài)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示：聯(lián)合預(yù)測因子pre1預(yù)測AE的AUC明顯大于各原始協(xié)變量。說明聯(lián)合預(yù)測因子的工作性能優(yōu)于S100B、Cys-C、MMP-9單獨作為診斷指標(biāo)預(yù)測AE的工作性能（圖5、表4）。

圖5 聯(lián)合預(yù)測因子及各原始協(xié)變量對繼發(fā)AE預(yù)測的ROC曲線Fig.5 ROC curves of combined predictors and original covariables for predicting secondary AE

表4 聯(lián)合預(yù)測因子及各原始協(xié)變量對繼發(fā)AE預(yù)測的ROC曲線參數(shù)Tab.4 ROC curve parameters predicted by combined predictors and original covariables for secondary AE

2.6 建立風(fēng)險預(yù)測模型及模型評價 根據(jù)多因素Logistic回歸分析結(jié)果構(gòu)建HSV感染患者繼發(fā)AE的風(fēng)險預(yù)測模型，P為模型預(yù)測概率，取值0～1。建立的預(yù)測模型如下：Logit（P）=-2.419+0.179（MRI異常）-1.091（腦脊液Cys-C）+0.712（腦脊液S100B）+0.329（腦脊液MMP-9）+0.310（EEG異常）。根據(jù)預(yù)測概率與繼發(fā)AE的關(guān)系建立ROC曲線（圖6），AUC=0.894（95%CI：0.736～0.979），表明預(yù)測模型具有較高診斷價值。模型校準(zhǔn)曲線如圖7所示，模型C-index值為0.803（95%CI：0.785～0.860），校準(zhǔn)圖中實際曲線與理想曲線較為貼合，表明該預(yù)測模型在預(yù)測HSV感染患者繼發(fā)AE的風(fēng)險值上表現(xiàn)出良好的一致性。

圖6 HSV感染患者繼發(fā)AE的風(fēng)險預(yù)測模型ROC曲線Fig.6 ROC curve of risk prediction model for secondary AE in patients with HSV infection

圖7 HSV感染患者繼發(fā)AE的風(fēng)險預(yù)測模型校準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curves of risk prediction models for secondary AE in patients with HSV infection

3 討論

HSV是病毒性腦炎常見病原體之一，可引起患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，嚴(yán)重時可導(dǎo)致患者死亡［9］。研究表明，臨床上患者發(fā)生中樞神經(jīng)感染，病情緩解后有再發(fā)生AE的可能［10］。AE是一種由某些自身抗體、活性細(xì)胞或相關(guān)因子與中樞神經(jīng)元表面受體相互作用導(dǎo)致的新型腦炎，具有難以診斷、病情嚴(yán)重等特點［11］。研究表明，腦脊液中S100B、Cys-C、MMP-9水平變化較血清更為顯著，對腦炎預(yù)測更為準(zhǔn)確，具有較高敏感度和特異度［12-13］。目前關(guān)于HSV感染患者繼發(fā)AE影響因素的探究較少。因此，本研究探討腦脊液中S100B、Cys-C、MMP-9水平對繼發(fā)AE的預(yù)測價值，以期為臨床預(yù)防HSV感染患者繼發(fā)AE提供參考。

S100B蛋白是一種極易通過血腦屏障的特異性蛋白，多數(shù)S100B蛋白分布于腦內(nèi)，生物活性廣泛，參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子依賴性生物學(xué)行為，對腦損傷程度反應(yīng)極為靈敏。腦脊液中S100B水平升高提示患者發(fā)生了神經(jīng)元損傷［14-15］。馮剛［16］研究表明重癥病毒性腦炎患者腦脊液S100B水平顯著升高，臨床干預(yù)病情穩(wěn)定后S100B水平逐漸回歸正常，且S100B水平越高的患者臨床不適癥狀越明顯，說明患者腦脊液S100B水平與腦組織損傷程度密切相關(guān)，提示臨床可通過檢測S100B水平判斷患者是否發(fā)生腦組織損傷及評估損傷程度。本研究中，繼發(fā)AE患者S100B平均水平顯著高于未繼發(fā)AE患者，說明腦脊液中高S100B水平對HSV感染病情緩解后繼發(fā)AE具有不利影響。Cys-C是一種經(jīng)腎小球濾過又由近曲小管吸收且完全代謝的腦源性蛋白，存在于腦脊液中［17］。近年Cys-C已被認(rèn)定為腦組織損傷標(biāo)志物。研究表明，腦脊液Cys-C降低與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，其原因為炎癥反應(yīng)增加血腦屏障通透性，部分Cys-C由腦脊液轉(zhuǎn)移至血清致使血清Cys-C水平升高，腦脊液中水平降低［18］。Cys-C在新陳代謝中對內(nèi)源性細(xì)胞起保護(hù)作用，可抑制細(xì)胞死亡和其他組織損害，通過抑制腦損傷分泌的半胱氨酸蛋白酶活性起機體保護(hù)作用。正常平衡被破壞時，Cys-C降低可增加組織蛋白酶破壞性，不利于患者病情恢復(fù)［19］。本研究中，研究組患者Cys-C水平顯著低于對照組，與患者病情嚴(yán)重程度、繼發(fā)AE可能性呈負(fù)相關(guān)，推測與上述作用機制相關(guān)。MMP-9是一種蛋白水解酶，具有較強的細(xì)胞外基質(zhì)分解活性，其作用為降解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞細(xì)胞基底膜、增加血腦屏障通透性，可由體內(nèi)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生［20］。MMP-9異常升高可引起異常組織重塑，參與腦組織損傷進(jìn)程，加重患者病情，干擾患者預(yù)后［21］。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在破壞神經(jīng)血管單元結(jié)構(gòu)時起決定性作用，隨著血腦屏障破壞，炎癥細(xì)胞入侵中樞神經(jīng)細(xì)胞，同時促使大量促炎因子分泌，進(jìn)而加重腦組織損傷［22］。

本研究分析腦脊液Cys-C、MMP-9與S100B的相關(guān)性，結(jié)果顯示HSV感染患者腦脊液Cys-C濃度與S100B水平呈負(fù)相關(guān)，MMP-9濃度與S100B水平呈正相關(guān)。說明HSV感染患者腦脊液中S100B含量發(fā)生異常時常伴隨腦脊液中Cys-C、MMP-9濃度變化。此外，本研究將腦脊液S100B、Cys-C、MMP-9作為協(xié)變量生成聯(lián)合預(yù)測因子pre1，結(jié)果顯示，聯(lián)合預(yù)測因子pre1預(yù)測HSV感染患者繼發(fā)AE的AUC明顯大于各原始協(xié)變量AUC，預(yù)測靈敏度為85.78%，特異度為90.36%，準(zhǔn)確率為88.43%。說明聯(lián)合檢測因子pre1的工作性能強于單一分析指標(biāo)時的工作性能，可有效提高對HSV感染患者繼發(fā)AE的預(yù)測效能，進(jìn)而降低AE發(fā)病率。構(gòu)建的風(fēng)險預(yù)測模型具有良好的區(qū)分度和一致性，在臨床上可有效評估HSV感染患者繼發(fā)AE風(fēng)險。

綜上，腦脊液中S100B、Cys-C、MMP-9水平均可對HSV感染患者誘發(fā)AE的可能性進(jìn)行有效預(yù)測，且三項指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測價值最大，其次是S100B蛋白、Cys-C、MMP-9。若能在合適時機、采取有效干預(yù)手段適當(dāng)抑制S100B、Cys-C、MMP-9失衡，有助于降低AE病發(fā)率。本研究仍存在一定局限性：樣本量較小，且為單中心回顧性研究，增加了研究對象選擇偏倚風(fēng)險，有待擴大規(guī)模進(jìn)一步研究。