唐笛嬌 王艷萍 鄒麟 陳瀑 李僑 （重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400060）

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是主要累及肝內(nèi)小葉間膽管的器官特異性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞死亡、膽囊周?chē)w維化、膽汁淤積，若控制不佳可進(jìn)展為肝纖維化甚至最終發(fā)展為肝硬化，已成為最常見(jiàn)的肝內(nèi)膽道疾病之一［1］。隨著對(duì)該疾病認(rèn)知和檢測(cè)水平提高，PBC全球發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)，我國(guó)發(fā)病率為49.2/10萬(wàn)［2］。目前PBC診斷基于特異性血清抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibody，AMA）對(duì)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基（PDC-E2）的反應(yīng)（＞95%患者）。PBC起病隱匿，發(fā)病機(jī)制不明，仍是自身免疫性肝病難點(diǎn)之一。PBC目前被認(rèn)為是一種多因素多基因疾病，許多動(dòng)物模型表明，對(duì)自身組織（抗原）喪失免疫耐受和產(chǎn)生自身抗體是PBC發(fā)生的基礎(chǔ)，在免疫信號(hào)、外源修飾蛋白和微生物免疫等共同作用下導(dǎo)致小葉間膽管炎發(fā)生［1］。肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（biliary epithelial cells，BECs）是肝細(xì)胞重要組成，其損傷機(jī)制是研究PBC發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。過(guò)度活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞是目前研究較多的方向，但仍未解釋PBC中BEC的攻擊特異性。最近一項(xiàng)研究表明，來(lái)自膽道小上皮細(xì)胞的凋亡小體可誘導(dǎo)PBC患者巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。AMA存在條件下，PBC患者巨噬細(xì)胞、BEC凋亡小體和AMA可組成三聯(lián)體，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子暴發(fā)［3］。提示巨噬細(xì)胞和AMAs與膽管損傷有關(guān)，并解釋了PBC的組織特異性。

IL-34是一種新型細(xì)胞因子，為分泌型同二聚體糖蛋白，是集落刺激因子1受體（colony-stimulating factors-1R，CSF-1R）的組織特異性配體，可激活多種信號(hào)通路，調(diào)控巨噬細(xì)胞主要功能，包括增殖、分化、生存、代謝、細(xì)胞因子/趨化因子表達(dá)及細(xì)胞黏附和遷移［4］。IL-34結(jié)合至CSF-1R有助于髓系細(xì)胞增殖和生存。此外，巨噬細(xì)胞在PBC患者中起重要作用［4-5］。盡管IL-34被認(rèn)為是幾種疾病的關(guān)鍵診斷指標(biāo)［6］，但I(xiàn)L-34與PBC、AMA的關(guān)系以及與PBC進(jìn)展的相關(guān)性尚未明確。因此，本研究探討IL-34在AMA陽(yáng)性PBC患者血清中的表達(dá)，更好地了解IL-34與PBC的關(guān)系，改善對(duì)PBC的認(rèn)知。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 收集2020年6月至2021年12月重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及兩所分院可檢測(cè)到AMA-M2陽(yáng)性的PBC患者49例，女47例，男2例，平均年齡（57.55±14.15）歲。PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的《原發(fā)性膽汁性膽管炎的診斷和治療指南（2021）》［7］。納入標(biāo)準(zhǔn)滿足以下3條標(biāo)準(zhǔn)中的2條：①存在膽汁淤積的生物化學(xué)證據(jù)，主要為堿性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)氨酶（GGT）升高，且影像學(xué)檢查排除肝外或肝內(nèi)大膽管梗阻；②AMA-M2陽(yáng)性；③組織學(xué)上有非化膿性破壞性膽管炎和小膽管破壞證據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他可能引起膽汁淤積相關(guān)生化指標(biāo)升高的疾病，包括病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝內(nèi)局部膽管梗阻、肝外膽管梗阻和藥物性肝損害等；②合并其他自身免疫病，如干燥綜合征；③接受過(guò)生物制劑、免疫抑制劑或激素治療。從重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心收集健康對(duì)照者50例，平均年齡（55.64±16.21）歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①性別和年齡與其他兩組基本匹配；②身體狀況好，無(wú)感冒、消化不良等不適；③既往無(wú)自身免疫病、傳染病和腫瘤病史，無(wú)自身免疫病和腫瘤相關(guān)家族史；④無(wú)其他可能引起肝臟酶學(xué)和或引起膽汁淤積生化指標(biāo)升高的疾病。收集每例PBC患者標(biāo)準(zhǔn)化病史并進(jìn)行體格檢查，9例未經(jīng)熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）治療的PBC患者入組后均接受13～15 mg/（kg·d） UDCA口服治療。9例患者UDCA治療6個(gè)月后再次收集血液樣本。收集PBC患者血清樣本，完成所有患者病史信息和體格檢查。所有患者均要求空腹，禁食8 h，避免血脂影響，早上空腹抽取外周靜脈血4 ml，孵育30 min，3 000 r/min離心6 min，收集血清于EP管，-80 ℃保存。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有操作按地區(qū)倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則和規(guī)范進(jìn)行，所有參與者知情同意。

1.1.2 試劑與儀器 ELISA檢測(cè)試劑盒（R＆amp;D，USA）；生化儀（Cobas 701，Roche，Switzerland）；特定蛋白分析儀（image 800，Beckman，USA）；歐蒙免疫印跡儀（EURO BlotMaster，Euroummun，Germany）；免疫分析儀（YHLO Union，YHLO，中國(guó)）；酶標(biāo)儀（Tecan，奧地利）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目包括：血常規(guī)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、GGT、ALP、乳酸脫氫酶（LDH）、三酰甘油（TG）、膽紅素（BIL）、IgG、IgM、抗線粒體抗體M2（AMA-M2）及細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α。以上各指標(biāo)均由實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化儀器檢測(cè)并按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)試。率比色法檢測(cè)血清AST、ALT、ALP、LDH、GGT、BIL和TG水平。比濁法測(cè)定血清IgG和IgM水平。免疫印跡法檢測(cè)血清AMA-M2。僅AMA-M2陽(yáng)性患者進(jìn)一步定量。ELISA測(cè)定人血清AMA-M2濃度，由免疫分析儀自動(dòng)進(jìn)行。化學(xué)發(fā)光法定量測(cè)定人血清IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α濃度。所有方法均按生產(chǎn)商操作流程執(zhí)行。

1.2.2 血清標(biāo)本IL-34水平測(cè)定 根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)采用ELISA試劑盒測(cè)定血清IL-34水平。收集49例患者和50例健康對(duì)照者血清，按照試劑說(shuō)明書(shū)要求制備所有試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。標(biāo)準(zhǔn)品制備：900 μl校準(zhǔn)品稀釋液移至100 μl濃度為2 000 pg/ml的原液標(biāo)準(zhǔn)品管，混勻后吸取500 μl轉(zhuǎn)移至第二管進(jìn)行對(duì)倍稀釋，使用原液產(chǎn)生稀釋系列7管，打開(kāi)微孔板密封袋，每孔加100 μl稀釋液后每孔加入50 μl待測(cè)血清、標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照，膠膜封板，室溫下在水平軌道微孔板搖床上振搖孵育2 h，軌道設(shè)置（500±50） RPM，用預(yù)先配制的洗滌緩沖液洗板3次，每孔加入400 μl洗滌緩沖液，每次均保證液體拍干無(wú)殘留，每孔加入200 μl人IL-34酶結(jié)合抗體，膠膜封板，室溫下水平軌道微孔板搖床振搖孵育2 h，重復(fù)上述洗板步驟3次，每孔加入200 μl底物溶液，室溫下在桌面避光孵育30 min，每孔加入50 μl終止液，酶標(biāo)儀在30 min內(nèi)測(cè)定450 nm處吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析，PBC患者與對(duì)照組采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析兩組間差異。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析IL-34水平與其他連續(xù)變量的關(guān)系。Spearman相關(guān)分析法分析IL-34與其他連續(xù)變量的關(guān)系。配對(duì)T檢驗(yàn)比較同一患者相同指標(biāo)治療前后差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料 PBC患者和健康對(duì)照者年齡、性別匹配，PBC患者血清ALT、AST、GGT、ALP、LDH、TG、BIL、IgG、IgM水平明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.05，表1），PBC患者臨床表現(xiàn)特點(diǎn)如表2所示，無(wú)明顯臨床癥狀患者13例。

表1 PBC患者及健康對(duì)照者基本資料（±s）Tab.1 Baseline clinical characteristics of PBC patients and controls （±s）

表1 PBC患者及健康對(duì)照者基本資料（±s）Tab.1 Baseline clinical characteristics of PBC patients and controls （±s）

Items Female/Male Age ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）GGT/（U·L-1）ALP/（U·L-1）LDH/（U·L-1）TG/（mmol·L-1）BIL/（mol·L-1）IgG/（g·L-1）IgM/（g·L-1）Control （n=50）48/2 55.64±16.21 18.70±8.64 21.42±4.28 20.88±8.62 71.76±18.25 165.20±25.11 0.93±0.25 11.53±3.61 12.24±1.94 1.45±0.56 PBC （n=49）47/2 57.55±14.15 66.84±87.08 66.84±64.67 158.43±156.27 204.29±249.84 542.73±378.71 2.82±3.51 82.41±138.63 16.79±6.15 2.68±2.70 P 0.683 0.625 0.024 0.017 0.020 0.018 0.024 0.016 0.014 0.032 0.034

表2 PBC患者臨床表現(xiàn)Tab.2 Clinical manifestation of PBC patients

2.2 PBC患者血清IL-34水平升高 比較49例PBC患者和50例健康對(duì)照者血清IL-34水平以探討IL-34在PBC發(fā)病中的作用，結(jié)果顯示PBC患者IL-34水平明顯高于健康對(duì)照組［82.37（22.57～264.20） pg/mlvs37.67（28.87～63.54） pg/ml，P＜0.05，圖1］。

圖1 PBC患者和健康對(duì)照者血清IL-34表達(dá)Fig.1 Serum IL-34 level in healthy control subjects and patients with PBC

2.3 IL-34與AMA-M2的相關(guān)性分析 AMA-M2是PBC最特異的標(biāo)志物，AMA存在下巨噬細(xì)胞被激活。收集數(shù)據(jù)的所有患者均檢測(cè)到AMA-M2，ELISA對(duì)AMA-M2進(jìn)行血清學(xué)定量檢測(cè)，結(jié)果顯示IL-34升高與AMA-M2定量相關(guān)（r2=0.16，P＜0.042，圖2A），但相關(guān)系數(shù)不佳，尚不足以證實(shí)正相關(guān)結(jié)論，需進(jìn)一步討論。

圖2 血清IL-34與各指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between serum IL-34 and each index

2.4 PBC患者血清IL-34水平與肝功能指標(biāo)及免疫球蛋白的關(guān)系 IL-34水平與ALT（r2=0.048，P=0.12）、AST（r2=0.007 9，P=0.54）、GGT（r2=0.002 8，P=0.71）、ALP（r2=0.001 4，P=0.79）、LDH（r2=0.05，P=0.12）、TG（r2=0.023，P=0.28）、BIL（r2=0.024，P=0.28）、IgG（r2=0.029，P=0.23）、IgM（r2=0.003 1，P=0.71）等均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系（圖2B～J）。

2.5 PBC患者血清IL-34水平與臨床表現(xiàn)的關(guān)系PBC患者臨床表現(xiàn)存在顯著個(gè)體差異。肝組織病理學(xué)檢查并非診斷必需，僅少數(shù)患者有肝組織活檢結(jié)果，無(wú)法根據(jù)肝臟病理學(xué)表現(xiàn)對(duì)入組患者進(jìn)行分期。根據(jù)臨床癥狀（表2）和肝功能指標(biāo)（表1）將患者分為3組：Ⅰ組無(wú)癥狀，僅肝功能指標(biāo)異常；Ⅱ組有臨床癥狀及肝功能指標(biāo)異常，但無(wú)肝硬化；Ⅲ組為肝硬化組。比較IL-34水平差異，結(jié)果顯示血清IL-34水平在不同臨床表現(xiàn)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

2.6 PBC患者血漿細(xì)胞因子濃度 如表4所示，PBC組血清IL-2、IL-6和TNF-α濃度顯著高于健康對(duì)照組。PBC血清IL-1、IL-8、IL-10濃度較健康對(duì)照組升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 PBC患者炎癥細(xì)胞因子濃度 ［Median （min～max）］Tab.4 Serum cytokine levels in patients with PBC and healthy controls ［Median（min-max）］

2.7 PBC患者血清IL-34水平與血清細(xì)胞因子水平的關(guān)系 分析PBC中IL-34與IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α等細(xì)胞因子的關(guān)系，IL-34與IL-1（r2=0.030，P=0.23）、IL-2（r2=0.002，P=0.72）、IL-6（r2=0.020，P=0.29）、IL-8（r2=0.050，P=0.12）、IL-10（r2=0.010，P=0.60）、TNF-α（r2=0.010，P=0.51）均無(wú)顯著相關(guān)性（圖3）。

圖3 血清IL-34與炎癥細(xì)胞因子的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between serum IL-34 and inflammatory cytokines

2.8 PBC患者血清IL-34水平治療前后對(duì)比 UDCA是治療PBC的一線藥物，選取9例治療前血清IL-34較健康對(duì)照明顯升高的患者進(jìn)行隨訪，UDCA治療后進(jìn)行血清IL-34檢測(cè)，結(jié)果表明PBC患者經(jīng)UDCA治療后血清IL-34水平顯著降低（P=0.023，圖4）。

圖4 血清IL-34治療前后變化Fig.4 Changes of serum IL-34 before and after treatment

3 討論

PBC被認(rèn)為是一種典型的自身免疫性疾病，其特點(diǎn)為存在抗線粒體抗體AMA和BEC特異性破壞結(jié)果。免疫抑制劑已被證明對(duì)PBC幾乎無(wú)效果［8］。PBC病因機(jī)制復(fù)雜，小膽管上皮細(xì)胞的靶向特異性是PBC發(fā)病機(jī)制的主要未解問(wèn)題。所有有核細(xì)胞均有線粒體，但PBC中僅有肝內(nèi)BECs和較小的唾液腺細(xì)胞是自身免疫攻擊的目標(biāo)。已有文獻(xiàn)證明BECs可將免疫完整的PDC-E2轉(zhuǎn)移至凋亡小體并形成凋亡細(xì)胞，確定研究巨噬細(xì)胞能夠解釋PBC的器官特異性［3］。深入了解巨噬細(xì)胞的預(yù)測(cè)指標(biāo)及其在PBC進(jìn)展中的功能作用對(duì)改善預(yù)后和治療有重要意義。本研究表明PBC患者血清IL-34水平顯著升高，并在一線藥物治療后顯著降低，血清IL-34和AMA-M2存在一定相關(guān)性。

IL-34是CSF-1R的替代配體，可促進(jìn)吞噬細(xì)胞增殖、存活、分化等多種生理功能和病理過(guò)程［9］。與僅和CSF-1R結(jié)合的CSF-1相比，IL-34可通過(guò)許多信號(hào)網(wǎng)絡(luò)與CSF-1R、PTPz和CD138結(jié)合，在某些細(xì)胞亞群中產(chǎn)生部分重疊作用，發(fā)揮對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用［4］。

研究表明IL-34在肝臟病變進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是慢性肝炎及肝組織炎癥、纖維化患者的血清學(xué)指標(biāo)［10］。免疫激活被認(rèn)為參與PBC發(fā)病機(jī)制，其中巨噬細(xì)胞激活是最受關(guān)注的。LLEO等［3］證實(shí)AMA存在下，膽道小上皮細(xì)胞凋亡小體可刺激患者巨噬細(xì)胞釋放強(qiáng)烈的炎癥細(xì)胞因子。CD1a陽(yáng)性的朗格漢斯細(xì)胞可能存在于PBC患者膽道上皮中［11］。越來(lái)越多的證據(jù)表明IL-34在單核吞噬細(xì)胞系增殖和分化、破骨細(xì)胞形成和炎癥中發(fā)揮重要作用［6］。PBC患者單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞與膽道小上皮細(xì)胞凋亡小體培養(yǎng)后，在AMAs存在下可顯著增加TNF-α相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體表達(dá)［12］。推測(cè)IL-34在PBC患者中對(duì)巨噬細(xì)胞激活可能發(fā)揮重要作用，為證實(shí)該假設(shè)，本研究全部選取AMA陽(yáng)性PBC患者，各種類(lèi)型（M1～M9）中，M2被認(rèn)為是診斷最特異的，但滴度與PBC疾病嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)［13］。

患者基本資料調(diào)查顯示，PBC部分患者無(wú)癥狀，但由于對(duì)該病認(rèn)知不足，仍有約1/3患者出現(xiàn)了肝硬化，部分患者初診時(shí)肝功能損傷較為嚴(yán)重，促進(jìn)該病的普及尤其是偏遠(yuǎn)地區(qū)，路仍然很長(zhǎng)。

本研究證實(shí)血清IL-34在PBC患者中有顯著的表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)，并與PBC患者其他炎癥因子水平顯著相關(guān)。與健康對(duì)照組相比，PBC患者血清IL-2、IL-6和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子顯著升高。但與預(yù)期一樣，IL-34表達(dá)與肝功能指標(biāo)、免疫球蛋白、病情嚴(yán)重程度及血清炎癥白介素表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性，但患者經(jīng)過(guò)治療后，血清IL-34表達(dá)顯著下降，提示IL-34對(duì)PBC患者疾病發(fā)生及巨噬細(xì)胞激活有一定作用，但與疾病發(fā)展無(wú)顯著相關(guān)性。報(bào)道顯示IL-6增強(qiáng)IL-34誘導(dǎo)免疫抑制巨噬細(xì)胞分化的病理過(guò)程［14］。IL-34引起的巨噬細(xì)胞活化可誘導(dǎo)分泌炎癥細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8和TNF-α等，其下游作用可在AMA存在情況下進(jìn)一步損傷BECs［15］。本研究雖表明血清IL-34和AMA-M2存在一定相關(guān)性，但經(jīng)過(guò)結(jié)果討論后認(rèn)為目前數(shù)據(jù)尚不足以支持IL-34和AMA-M2定量結(jié)果存在正相關(guān)關(guān)系，且IL-34表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)，需要更大樣本量對(duì)該結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

膽汁上皮細(xì)胞的免疫損傷循環(huán)導(dǎo)致膽汁淤積和肝細(xì)胞纖維化。PBC免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。參與破壞膽管的免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞在PBC中的作用已有一些研究［16］。因此本研究關(guān)注單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。IL-34在單核吞噬細(xì)胞、譜系細(xì)胞和炎癥增殖分化中起重要作用［17-18］。PBC中通過(guò)T和B細(xì)胞相互作用，AMAs產(chǎn)生特定于PDC-E2的組分，激活免疫細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞）。只有在AMAs存在情況下，PBC患者巨噬細(xì)胞與人BEC凋亡小體培養(yǎng)后才會(huì)分泌促炎細(xì)胞因子，包括高水平的IL-6（促炎，誘導(dǎo)IL-34表達(dá)）、IL-17（促炎，誘導(dǎo)IL-34表達(dá)）和TNF-α（誘導(dǎo)BEC凋亡或衰老）［19］。BECs死亡后進(jìn)一步釋放PDC-E2，產(chǎn)生更多凋亡小體，IL-34介導(dǎo)一個(gè)正反饋回路促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖分化。另一方面，IL-34是一種參與纖維原性巨噬細(xì)胞活化誘導(dǎo)的細(xì)胞因子，與肝纖維化和炎癥嚴(yán)重程度相關(guān)［20］。綜上，AMA存在下，IL-34介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活對(duì)BEC造成了特異性損傷。

本研究證明IL-34血清表達(dá)在AMA-M2陽(yáng)性PBC患者中升高，并在治療有效患者中水平明顯降低。PBC患者血清IL-34表達(dá)與部分炎癥因子呈正相關(guān)，提示AMA存在情況下，IL-34介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化對(duì)肝BEC造成了特異性損傷。本研究揭示IL-34可能是PBC發(fā)生和潛在治療的重要炎癥介質(zhì)，血清IL-34可能成為PBC的候選生物標(biāo)志物。

(3)在區(qū)域內(nèi)部不平等貢獻(xiàn)率中，城市群地區(qū)對(duì)總的收入不平等程度的貢獻(xiàn)占比最高并不斷提升，從1986年與非城市群地區(qū)對(duì)總的收入不平等貢獻(xiàn)率從36.7∶62.0上升到2014年24.5∶72.9。其結(jié)果意味著，城市群地區(qū)對(duì)總收入不平等的貢獻(xiàn)率比重將進(jìn)一步提升，這可能是由于城鎮(zhèn)化引起的，因此中國(guó)在未來(lái)加快城鎮(zhèn)化過(guò)程的同時(shí)要防范區(qū)域收入不平等的進(jìn)一步加劇。

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