白冰,何靜,楊靜,趙明林,王清福,陳芝飛,王秋領(lǐng)

1(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州,450000)2(河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,河南 鄭州,450000)

還原糖與氨基酸參與的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生了包括香味成分在內(nèi)的大量產(chǎn)物,根據(jù)反應(yīng)條件的不同,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味也隨之改變,其中2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4(H)吡喃-4-酮(2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one,DDMP),是美拉德反應(yīng)極其重要的中間體之一,對美拉德反應(yīng)的調(diào)控起到關(guān)鍵作用。對DDMP的研究始于二十世紀(jì)60年代末。1967年,TATUM等[1]報(bào)道了橙汁粉中存在的一種呋喃烯醇酮化合物,同年,SHAW等[2]在己糖酸降解產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)了這種化合物。但直到1970年,MILLS等[3]對該化合物進(jìn)行核磁、質(zhì)譜表征,才證實(shí)了TATUM和SHAW所報(bào)道的是同一種化合物,并將其結(jié)構(gòu)更正為2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one(圖1)。隨后,在眾多的天然和加工食品中也不斷發(fā)現(xiàn)DDMP的存在。由于DDMP具有廣泛的生理活性,降解產(chǎn)物對食品風(fēng)味及安全性有重要的影響,作為香料前體物和藥物具有良好的開發(fā)前景,近年來受到了極大的關(guān)注。

圖1 DDMP結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of DDMP

1 DDMP的存在

DDMP廣泛存在于天然食品、加工食品和一些藥用植物及中藥材中。GURAV等[4]利用GC-MS對印度花椒果實(shí)的甲醇提取物進(jìn)行鑒定,無論是成熟還是完熟的花椒果實(shí)中均含有一定量的DDMP,且完熟的花椒果實(shí)中DDMP含量更高。SIDDEEG等[5]通過GC-MS分析了椰棗的揮發(fā)性成分,其中DDMP含量接近10%,可能是椰棗中抗氧化的關(guān)鍵成分。ALI等[6]比較了5個品種芒果果皮提取物成分差異,以及抗氧化和抗增殖活性,發(fā)現(xiàn)DDMP是芒果皮中主要的活性成分,在治療人類宮頸癌以及作為抗氧化劑在食品和醫(yī)藥工業(yè)中有潛在的應(yīng)用。PADMASHREE等[7]在旋花科植物海南薯中發(fā)現(xiàn)DDMP。研究者們從食用擔(dān)子菌日本白雪茸中分離得到了DDMP,通過HPLC法測得其含量為3.5 mg/g,活性測試結(jié)果表明,DDMP為白雪茸中主要的抗氧化活性物質(zhì)之一[8-9]。陳凡等[10]對番石榴果進(jìn)行提取得到了芳香浸膏,并采用GC-MS對芳香浸膏進(jìn)行成分分析, 鑒定出了5-羥甲基糠醛(71.47%)、DDMP(6.44%)、糠醛(4.69%)、乙酸(2.54%)、庚酸(1.70%) 等為番石榴浸膏的主要成分。RODRIGUEZ等[11]利用超臨界CO2萃取對牛蒡根進(jìn)行提取,并利用GC-MS對提取物進(jìn)行分析,結(jié)果顯示牛蒡提取物中的主要成分為鄰苯二甲酸二異辛酯、DDMP、甘油和十五醛。

食品的熱加工過程也會大量積累DDMP。BIN等[12]對全麥面包中苦味成分進(jìn)行了研究,鑒定出了包括DDMP在內(nèi)的8種化合物,其中DDMP的含量與面包皮中的感知苦味呈極顯著相關(guān)(α=0.01),推測其為全麥面包苦味的主要呈味物質(zhì)。PEREIRA等[13]發(fā)現(xiàn)咖啡濕加工過程會產(chǎn)生DDMP。SUN等[14]發(fā)現(xiàn)DDMP存在于經(jīng)過熱加工的大蒜油中。QIN等[15]利用GC-MS對玫瑰茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)DDMP 含量僅次于苯乙醇和丁香酚,是玫瑰茶中的主要成分之一。LASEKAN[16]對油莎草油進(jìn)行GC-MS分析,共鑒定出包括DDMP在內(nèi)的75種氣味活性揮發(fā)物,通過風(fēng)味稀釋因子和氣味活性值對香氣貢獻(xiàn)進(jìn)行量化,發(fā)現(xiàn)DDMP對油莎草油的香氣有重要貢獻(xiàn)。HWANG等[17]從加熱過的洋蔥中分離鑒定出了DDMP,并對其進(jìn)行了抗氧化活性測試;HWANG等[18]又利用活性跟蹤的手段,從經(jīng)過熱處理的沙梨果汁的乙酸乙酯提取部分分離鑒定出了DDMP。呂姍等[19]考察不同烘焙溫度對大棗品質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)隨著烘焙溫度的升高,DDMP含量也不斷提高,QIAO等[20]、SONG等[21]建立了頂空固相微萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法,對烘焙紅棗中的DDMP含量進(jìn)行了測定,該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.01～100 μg/mL呈線性,檢測限為0.1 ng/g,所測定的5種烘焙紅棗中DDMP含量在4.55～46.50 μg/g。

在藥用植物中也發(fā)現(xiàn)了DDMP的存在,一些中藥材在炮制過程也會產(chǎn)生DDMP。RAGUPATHI RAJA KANNAN等[22]利用GC-MS對幾種具有藥用價值的海草成分進(jìn)行分析,鑒定出包括DDMP在內(nèi)的24種化合物,這也是首次發(fā)現(xiàn)DDMP存在于海草中。印度葛根是傳統(tǒng)上被用作抗衰老保健食品,SHUKLA等[23]對其水提取物腎臟保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其作用是通過水提物中的抗氧化活性化合物抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的,而DDMP是葛根水提物中含量最高的成分之一,對其活性起到關(guān)鍵作用。錢曉東等[24]研究加熱炮制對不同來源當(dāng)歸藥材新產(chǎn)生成分的影響,結(jié)果顯示,當(dāng)歸加熱炮制后,會生成5-羥甲基糠醛和DDMP 兩個新的化學(xué)成分。

近年報(bào)道的部分DDMP來源及潛在功能見表1。

表1 DDMP來源及潛在功能Table 1 Sources and potential functions of DDMP

2 DDMP的形成與降解

上述天然和加工食品中存在的DDMP,一般認(rèn)為是通過美拉德反應(yīng)及Amadori化合物降解產(chǎn)生,大多數(shù)研究認(rèn)為來源于己糖降解,其中1-脫氧葡萄糖醛酮(1-deoxy-D-glucosone,1-DG)是形成DDMP的關(guān)鍵中間體。

ZHOU等[43]研究了固相美拉德反應(yīng)體系中多種因素對DDMP形成的影響,比較了還原糖(葡萄糖或果糖)和幾種氨基酸(L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-酪氨酸和L-賴氨酸)作為原料形成DDMP的反應(yīng)活性。研究發(fā)現(xiàn),在脯氨酸與葡萄糖反應(yīng)體系中,DDMP生成量較大,且在葡萄糖與脯氨酸的物質(zhì)的量比為2∶1時達(dá)到最高水平;氧氣對DDMP的形成沒有明顯影響。DDMP形成的動力學(xué)研究表明,DDMP在形成的初始階段為一級反應(yīng),其活化能為68.8 kJ/mol。這說明在美拉德反應(yīng)中,DDMP的形成極大依賴于底物種類(糖、氨基酸)及底物的比例。

1-DG在己糖參與的美拉德反應(yīng)中作為高活性中間體,對美拉德產(chǎn)物的形成起著重要作用。VOIGT等[44]對1-DG的降解進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)1-DG在O2存在下,其主要的降解產(chǎn)物為乳酸和甘油酸(圖2)。而DDMP能夠通過水合作用形成少量的1-DG,且DDMP在O2催化下的降解產(chǎn)物與1-DG完全相同。由此推測在美拉德反應(yīng)中,糖與氨基酸首先形高活性中間體1-DG,1-DG隨后降解形成DDMP。

圖2 1-DG的降解Fig.2 Degradation of 1-DG

學(xué)者們對基于葡萄糖-氨基酸模型的固相和液相美拉德反應(yīng)進(jìn)行了研究,以進(jìn)一步明確1-DG 形成DDMP的條件(圖3)[45-47]。

結(jié)果顯示,賴氨酸和脯氨酸分別在液相和固相反應(yīng)系統(tǒng)中促進(jìn)了DDMP的產(chǎn)生,這表明反應(yīng)強(qiáng)度和氨基酸性質(zhì)是介導(dǎo)DDMP產(chǎn)生的主要因素。通過對DDMP形成的烯醇化前體物進(jìn)行定量監(jiān)測,表明其途徑為2,3-烯醇化產(chǎn)生1-DG,1-DG進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為DDMP,水分含量較低的條件下易于形成DDMP;相應(yīng)的,在水分含量較高的體系中,由于2,3-烯醇化轉(zhuǎn)變?yōu)?,2-烯醇化,其中間體為3-脫氧葡萄糖醛酮,最終轉(zhuǎn)化為5-羥甲基糠醛。

KIM等[48]認(rèn)為DDMP也只是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物,為了證實(shí)這一點(diǎn),他們對不同條件下的DDMP熱解反應(yīng)進(jìn)行了研究,模擬了烘焙和弱酸性水溶液加熱2種體系條件,通過同位素標(biāo)記的方法,檢測了DDMP的降解產(chǎn)物。結(jié)果表明,DDMP在pH 5.8的水溶液中150 ℃加熱1 h,有30%發(fā)生降解,生成56種化合物,降解產(chǎn)物中2,3-戊二酮含量最高(19%),其次是2-甲基-3-呋喃酮(15.4%)、1-羥基丙酮(3.9%)等;當(dāng)DDMP置于220 ℃下加熱30 min,鑒定出了13種化合物,主要以5-羥基麥芽酚、麥芽酚、二氫麥芽酚、呋喃酮、2,4-二羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮等吡喃或呋喃烯醇酮類焦甜香物質(zhì)為主,結(jié)合13C標(biāo)記位置,可推測其形成途徑如下(圖4)。

圖4 DDMP在220 ℃條件下的降解途徑及產(chǎn)物Fig.4 Degrade pathway and products of DDMP under 220 ℃

由此可見,DDMP在美拉德反應(yīng)中扮演著中間體的角色,還原糖首先與氨基酸經(jīng)Amadori重排,繼而通過1-DG生成DDMP,氨基酸和糖的種類,反應(yīng)的濕度條件對DDMP的生成影響較大。而DDMP在氧化劑作用下降解生成小分子酸,在中性高溫條件及潮濕酸性條件下可降解生成不同的呋喃、吡喃類風(fēng)味物質(zhì),賦予美拉德反應(yīng)特有的焦甜香風(fēng)格。

3 DDMP的生理活性

3.1 抗氧化活性

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有廣泛的抗氧化活性[49-50],但其中主要的活性化合物尚不完全清楚。YU等[51]對葡萄糖-組氨酸參與的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究。采用Bio-gel P-2聚丙烯酰胺凝膠色譜柱對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了分段,并對各段的抗氧化活性進(jìn)行了評價。結(jié)果表明H7組分具有最強(qiáng)的抗氧化活性,通過GC-MS分析和HPLC分析確定了H7中的主要化合物為DDMP。對DDMP清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基能力和還原能力進(jìn)行了測定,表明DDMP具有強(qiáng)抗氧化活性,對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性的貢獻(xiàn)最大。

熱加工食品由于涉及美拉德反應(yīng),在加工過程產(chǎn)生的DDMP同樣會對食品的抗氧化能力產(chǎn)生影響。ECHOVSK等[32]研究了不同干燥溫度下處理的西梅的抗氧化能力。結(jié)果顯示低溫干制(60 ℃)對西梅的抗氧化能力影響不明顯,而高溫(>75 ℃)干制促進(jìn)西梅抗氧化能力顯著提高。進(jìn)一步研究表明,在高溫干制過程中,DDMP含量明顯增加,且其增加量和抗氧化能力呈正相關(guān)性。

有學(xué)者研究了DDMP結(jié)構(gòu)與抗氧化能力之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)當(dāng)烯醇式羥基被鍵合后,DDMP失去了抗氧化活性,而當(dāng)C-3位仲醇羥基被鍵合后,DDMP仍然保持抗氧化能力,說明DDMP的抗氧化能力與其烯醇酮結(jié)構(gòu)密不可分[52-53]。通過核磁共振氫譜譜圖可以看出,DDMP淬滅DPPH自由基按照1∶2的物質(zhì)的量之比進(jìn)行,由此推測DDMP抗氧化過程涉及2步反應(yīng)(圖5)。首先,DDMP被氧化為5-羥基-6-甲基-2H-吡喃-3,4-二酮,并迅速異構(gòu)化為5-羥基麥芽酚,5-羥基麥芽酚繼續(xù)被氧化,最終降解生成開環(huán)產(chǎn)物。通過核磁共振碳譜譜圖δ206～197和δ174 ～168處的信號,可以看出開環(huán)產(chǎn)物主要是酮和酸。這與KANZLER等[54]的研究一致,即DDMP在起到抗氧化作用的同時,自身也被氧化降解為甘油酸和乳酸。

圖5 DDMP抗氧化機(jī)理Fig.5 Proposed antioxidant mechanism of DDMP

3.2 抗腫瘤活性

BAN等[55]研究了從洋蔥中分離的DDMP通過調(diào)節(jié)NF-κB活性,從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡死亡的作用。結(jié)果顯示,不同質(zhì)量濃度的DDMP(0.5～1.5 mg/mL)作用不同時間(0～48 h)均能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞(SW620和HCT116)的生長,并呈劑量依賴關(guān)系。DDMP對腫瘤壞死因子α(TNF-α)和醋酸佛波醇誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄和DNA結(jié)合活性有調(diào)節(jié)作用。此外,DDMP也可抑制NF-κB靶向抗凋亡基因,同時誘導(dǎo)凋亡基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明,洋蔥中的DDMP通過抑制NF-κB而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而起到抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用。

3.3 神經(jīng)活性

BEPPU等[56]報(bào)道了從戊糖乳桿菌菌株S-PT84培養(yǎng)上清液中分離到3個化合物,并對其對大鼠腎交感神經(jīng)活性的影響進(jìn)行了研究。其中DDMP增加大鼠的腎交感神經(jīng)活性最高,增加量為408%。通過十二指腸注射DDMP可增加棕色脂肪組織交感神經(jīng)活性[(118±15.3)%],而通過口腔內(nèi)注射DDMP可使大鼠體溫高于肩胛間棕色脂肪組織的溫度[(0.72±0.13) ℃]。這些結(jié)果表明DDMP可以促進(jìn)自主神經(jīng)的活動。

3.4 抑菌活性

血紅密孔菌是一種常見于熱帶及亞熱帶低中海拔林區(qū)的木材腐生菌,其次生代謝產(chǎn)物有很強(qiáng)的抑菌作用,可作為生物活性化合物的潛在來源。TEOH等[57]研究了麥芽提取物、酵母提取物、葡萄糖和麥芽糖作為培養(yǎng)基對血紅密孔菌代謝產(chǎn)物抗菌活性的影響,并采用GC-MS分析了該菌提取物中的成分,結(jié)果表明DDMP是血紅密孔菌發(fā)酵液的主要成分,也是起到抑菌作用的主要活性成分。

3.5 心臟保護(hù)活性

CORDERO等[30]研究了酸角果實(shí)在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性模型中的心臟保護(hù)作用。與陽性對照纈沙坦相比,酸角果實(shí)提取物顯著(P<0.05)降低了C反應(yīng)蛋白、血清肌鈣蛋白I、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶和肌酐激酶MB、總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量,并能提高高密度脂蛋白含量。分子對接結(jié)果表明,酸角果實(shí)主要成分中的DDMP與人血管緊張素II 1型受體有很高的親和性,說明DDMP是酸角果實(shí)中起到心臟保護(hù)作用的關(guān)鍵化合物。

4 DDMP感官特性

由于DDMP在熱加工食品中廣泛存在,其對食品感官上的影響不容忽視,長期以來,對DDMP感官感受一直存在爭議。

DDMP屬于吡喃烯醇酮類化合物,在結(jié)構(gòu)上與常用焦糖香物質(zhì)麥芽酚、呋喃酮等類似,具有揮發(fā)性,同時兼具較高的脂溶性和水溶性。PITTET等[58]認(rèn)為,這類具有平面狀烯醇-羰基結(jié)構(gòu)的環(huán)狀二碳基化合物往往具有焦糖樣香味,因此DDMP在早期被描述為具有焦糖樣氣味,但SHAW等[59]通過反復(fù)重結(jié)晶得到的DDMP幾乎沒有氣味,KIM等[48]也發(fā)現(xiàn)DDMP盡管無氣味,但加熱后會產(chǎn)生焦糖樣以及融化的黃油氣味。也有研究認(rèn)為DDMP具有烘焙香氣[60]。

隨后對DDMP感官特性的研究主要集中在味覺上。周志磊[61]報(bào)道了DDMP在水溶液中的甜味閾值為0.25 g/L,并且和卷煙主流煙氣的“甜感”呈顯著的正相關(guān)。而BIN等[12]則認(rèn)為,DDMP的含量與全麥面包皮中的苦味呈極顯著相關(guān),因此被認(rèn)為是全麥面包皮中主要的苦味呈味物質(zhì)。LI等[62-64]也認(rèn)為,DDMP是焦糖化反應(yīng)以及美拉德反應(yīng)中的主要苦味物質(zhì),一些酚酸類物質(zhì)如沒食子酸、咖啡酸等,可以通過抑制1-DG的氧化降解從而阻止DDMP的生成。

對上述爭議進(jìn)行深入研究可以發(fā)現(xiàn), DDMP感官評價的不確定性主要受所制備的DDMP對照樣品純度的影響。DDMP無商品化來源,其對照樣品的制備無論是以葡萄糖為原料合成,還是以食品為原料進(jìn)行分離得到,均基于美拉德或焦糖化反應(yīng),期間有大量的物質(zhì)包括苦味物質(zhì)生成,由于DDMP產(chǎn)率極低,在純化時不可避免會引入苦味雜質(zhì)。為此,CHEN等[65]以麥芽酚為原料合成了DDMP,避免了復(fù)雜的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物生成,感官評價表明,該方法合成的DDMP無任何味覺感受,而通過經(jīng)典方法合成的DDMP確實(shí)有苦味。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)典方法合成的DDMP通過LH-20凝膠純化后,苦味消失,說明其苦味主要受美拉德反應(yīng)所帶來的副產(chǎn)物的影響,而純凈的DDMP為無味化合物。

5 DDMP的制備

作為美拉德反應(yīng)中間體,DDMP的制備可通過美拉德反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。經(jīng)典的合成方法以葡萄糖為原料,并通過二級胺和有機(jī)酸催化,使反應(yīng)停留在DDMP生成階段;由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物復(fù)雜,DDMP的純化同樣重要。VAN DEN OUWELAND等[66]以葡萄糖為原料,哌啶和乙酸為催化劑,通過連續(xù)萃取、柱層析、重結(jié)晶等純化步驟制得了DDMP,最終產(chǎn)率為5%;陳永寬等[67]參照上述合成條件,通過萃取、減壓蒸餾、重結(jié)晶等步驟得到的DDMP產(chǎn)率為3%。由此可見,DDMP產(chǎn)率不僅受合成條件影響,同時很大程度上受純化條件影響。

CHEN等[65]以麥芽酚為原料,通過酯化保護(hù)、氫化還原、乙酰氧化、酶水解和堿水解5步反應(yīng)合成了DDMP(圖6)。該合成路線的關(guān)鍵在于二乙?；鵇DMP的水解,甲醇鈉、NaOH、K2CO3、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene,DBU)等常見堿水解體系使得產(chǎn)物極其復(fù)雜難以分離。通過對脂肪酶的篩選,確定了利用假絲酵母菌來源的脂肪酶可高效水解3位乙酰基,進(jìn)而利用弱堿Na2CO3可水解掉5位乙?；?反應(yīng)總產(chǎn)率30%左右,利用該方法可獲得高純度DDMP。

圖6 DDMP合成路線Fig.6 Synthesis of DDMP from maltol

6 展望

食品中的美拉德反應(yīng)以及后續(xù)反應(yīng)非常復(fù)雜,在產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)和活性物質(zhì)的同時,也會產(chǎn)生一些有害物質(zhì),因此,對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行控制一直是研究的熱點(diǎn)[68],但目前為止,尚沒有可靠的調(diào)控方法,而DDMP作為美拉德反應(yīng)中的重要中間體,是許多風(fēng)味物質(zhì)的前體,或許是美拉德反應(yīng)調(diào)控的關(guān)鍵。目前,盡管已在模型水平上對DDMP形成及降解的影響因素和途徑有了初步的研究,但在食品基質(zhì)中研究尚未開展,因此,未來有必要進(jìn)一步加強(qiáng)食品基質(zhì)中DDMP的相關(guān)研究,從而更好的指導(dǎo)美拉德反應(yīng)風(fēng)味物質(zhì)的靶向調(diào)控。

DDMP具有廣泛的抗氧化、心臟保護(hù)等作用,作為食品功能添加劑和藥物開發(fā)有著良好的前景;此外,DDMP受熱釋放呋喃酮、麥芽酚等香味物質(zhì),可作為特色焦甜香香料前體進(jìn)行開發(fā),應(yīng)用于卷煙、食品等的緩釋加香。目前DDMP產(chǎn)品產(chǎn)率偏低,因此,有必要進(jìn)一步加強(qiáng)DDMP制備技術(shù)研究,以滿足作為活性物質(zhì)和香料開發(fā)的需求。