熊詩琳，林小荷，黃松，侯少貞，劉昌輝，姜小艷，梁健

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）發(fā)病始于直腸，通常以連續(xù)方式向近端延伸，穿過部分或整個結(jié)腸，是一種慢性結(jié)腸黏膜炎癥性疾病。近年來，UC 在全球的發(fā)病率不斷上升[1-2]。雖然目前臨床治療UC 的藥物選擇不斷增多，包括腫瘤壞死因子（TNF）和小分子藥物（Janus 激酶抑制劑）等[3-4]。但由于治療藥物存在價格昂貴、療效不穩(wěn)定和存在不良反應(yīng)等問題，容易導(dǎo)致患者病情反復(fù)和產(chǎn)生耐藥性等，而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[5]。盡管藥物治療選擇擴(kuò)大了范圍，仍有10%～20%的UC 患者需要進(jìn)行手術(shù)切除治療[6]。而中醫(yī)治療可通過結(jié)合UC 的不同發(fā)病機(jī)制，發(fā)揮中藥復(fù)方具有多靶點、整體調(diào)節(jié)等優(yōu)勢進(jìn)行治療[7]。

生姜瀉心湯源自于《傷寒論》，由生姜、半夏、黃芩、黃連、人參、干姜、炙甘草和大棗組成，該方寒熱并用，苦辛并施，是治療胃腸道疾病的常用方藥，具有使升降復(fù)、腸胃和之功[8-9]。由于中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多通路等特點，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，利用其從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，解析藥物及其治療對象之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律的優(yōu)點，高效篩選和預(yù)測生姜瀉心湯藥物成分靶點，預(yù)測復(fù)方藥物有效成分與治療UC 相關(guān)靶點的作用機(jī)制，并采用分子對接技術(shù)和細(xì)胞實驗加以驗證。為生姜瀉心湯臨床治療UC 以及后續(xù)實驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco2 細(xì)胞）購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于5%二氧化碳37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實驗試劑及儀器噻唑藍(lán)（MTT）、脂多糖（LPS）購于碧云天生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購于上海麥克林生化科技有限公司；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol RNA 提取試劑和SYBR Green qPCR 試劑盒購于瑞真生物科技有限公司；重組兔單克隆抗體p53（48599）、兔單克隆抗體AKT1/2（48888）購自美國Signalway Antibody 公司；兔單克隆抗體IL-1β（EPR24895-116）購自美國Abcam 公司。CFXRCR 擴(kuò)增儀購自美國BIO-RAD 公司；LSM800 蔡司激光共聚焦顯微鏡購自德國Carl Zeiss 公司；賽默飛Multiskan FC 型酶標(biāo)儀、NanoDrop2000 核酸濃度檢測儀購自美國Thermo Fisher 公司。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

1.3.1 生姜瀉心湯活性成分及作用靶點篩選分別以生姜瀉心湯方所包括的單味中藥（如生姜、半夏、黃芩、黃連、人參、干姜、炙甘草和大棗）為檢索詞，通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/index.php）檢索其活性成分。篩選條件為：口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中檢索各個靶點對應(yīng)基因名稱，整合去重處理后獲得生姜瀉心湯活性成分的預(yù)測靶點。

1.3.2 “復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”的靶點獲取及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、TTD（https：//db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank（https：//go.drugbank.com/）、PharmGBK（https：//www.pharmgkb.org/）數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“ulcerative colitis”進(jìn)行檢索，將得到的所有靶點進(jìn)行整理、去重、匯總。利用R.4.0.3 軟件（https：//www.r-project.org/）篩選得到生姜瀉心湯和UC 的共同靶點，并利用Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建生姜瀉心湯治療UC 的“復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，以Degree 值排序獲取核心作用成分。

1.3.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲈?/p>

STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）導(dǎo)入交集靶點，并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。同時，將該物種設(shè)置為“homo sapiens”，所需的最小交互得分設(shè)置為0.9，并刪除斷開的節(jié)點。然后，將復(fù)雜蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系文件數(shù)據(jù)輸入到Cytoscape 3.7.0 軟件中，使用插件CytoNCA 計算節(jié)點的六個參數(shù)，即介數(shù)中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）和局部平均連通性（LAC）。最后，根據(jù)候選靶點的6 個參數(shù)應(yīng)高于中位值原則來篩選核心靶點。

1.3.4 分子對接驗證根據(jù)以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，對核心組分以及核心蛋白進(jìn)行模擬虛擬分子對接。于PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取核心化學(xué)組分的3D 結(jié)構(gòu)式（包括AKT1、TP53 和IL-1β），于RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB，https：//www.rcsb.org/）獲取靶點結(jié)晶結(jié)構(gòu)。將其結(jié)果利用Maestro 軟件進(jìn)行結(jié)果處理和可視化。

1.4 細(xì)胞實驗驗證

1.4.1 MTT 分析將對數(shù)生長期的Caco2（1×103個/孔）細(xì)胞種于96 孔板中，培養(yǎng)12 h 后，加入不同濃度的生姜瀉心湯（0、12.5、25、50、100、200 和400 μg/mL），干預(yù)24 h 后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），并于培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，吸掉培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，隨后使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測量每孔吸光度。將對數(shù)生長期的Caco2（1×103個/孔）細(xì)胞種于96 孔板中，培養(yǎng)12 h 后，給予LPS（1 mg/mL）刺激，同時加入不同濃度的生姜瀉心湯（12.5、25、50、100、200 和400 μg/mL），干預(yù)24 h 后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），并于培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，吸掉培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，隨后使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測量每孔吸光度。

1.4.2 RT-PCR 分析生姜瀉心湯干預(yù)后基因的表達(dá)將對數(shù)生長期的Caco2（1×105個/孔）細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為Ctrl 組、LPS組、LPS+生姜瀉心湯25 μg/mL 組、LPS+生姜瀉心湯50 μg/mL 組和LPS+生姜瀉心湯100 μg/mL 組5 組；Ctrl 組細(xì)胞給予等體積的培養(yǎng)基，LPS 組加入等體積的培養(yǎng)基（含有1 mg/mL 的LPS），各濃度的生姜瀉心湯組加入對應(yīng)濃度的生姜瀉心湯，同時加入1 mg/mL 的LPS，干預(yù)24 h；收集每組細(xì)胞，用Trizol 試劑提取總RNA，測定RNA 的濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)試劑盒說明書對樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 引物如下：AKT1 正向為5′-AGCGACGTGG CTATTGTGAAG-3′，AKT1 反向為5′-GCCATCATTCT TGAGGAGGAAGT-3′；IL-1β 正向為5′-ATGATGGCT TATTACAGTGGCAA-3′，IL-1β 反向為5′-GTCGGAG ATTCGTAGCTGGA-3′；TP53 正向為5′-CAGCACAT GACGGAGGTTGT-3′，TP53 反向為5′-TCATCCAAA TACTCCACACGC-3′，GAPDH 作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；循環(huán)40 次。根據(jù)公式2-△△CT計算目標(biāo)基因的表達(dá)情況。

1.4.3 免疫熒光分析生姜瀉心湯干預(yù)后蛋白的表達(dá)將Caco2（1×104個/孔）細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后，分為Ctrl 組、LPS 組及生姜瀉心湯組。LPS 組及生姜瀉心湯組給予LPS 刺激，此外生姜瀉心湯組給予100 μg/mL 的生姜瀉心湯干預(yù)24 h。各組細(xì)胞用4%多聚甲醛常溫固定15 min，封閉、通透30 min，4 ℃過夜孵育一抗（anti-AKT1、anti-TP53和anti-IL-1β），室溫孵育熒光二抗2 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染，經(jīng)共聚焦顯微鏡觀察生姜瀉心湯對靶蛋白的作用。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用成組t檢驗，同組治療前后比較采用配對樣本t檢驗；多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（ANOVA），若數(shù)據(jù)方差齊，采用LSD 檢驗；方差不齊，采用Dunnett′sT3 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生姜瀉心湯活性成分及其治療UC 潛在靶點預(yù)測結(jié)果見圖1A。通過GeneCards 檢索并使用中位數(shù)獲取UC 核心靶點，得到靶點5 332 個，檢索OMIM得到靶點7 個，檢索TTD 得到靶點40 個，檢索PharmGKb 得到靶點15 個，檢索DrugBank 得到靶點11 個，合并去重得到UC 靶點5 186 個。見圖1B。通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索等方式，以O(shè)B值和DL 值為依據(jù)，共得生姜瀉心湯有效活性成分215 個。其中半夏13 個，大棗29 個，甘草91 個，干姜5 個，黃連14 個，黃芩36 個，人參22 個，生姜5 個，將所有活性成分整合去重后得到191 種唯一的活性成分，其中191 種唯一活性成分中有247 個對應(yīng)靶點。根據(jù)篩選去重后的生姜瀉心湯有效活性成分對應(yīng)的靶點，利用Venny 2.1 繪制韋恩圖，得到UC 靶點與生姜瀉心湯藥物活性成分靶點的共同靶點171 個，即生姜瀉心湯治療UC 的潛在作用靶點。

圖1 生姜瀉心湯治療UC 的潛在靶點

2.2 “復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”的靶點獲取及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果見圖2。將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建生姜瀉心湯治療UC 的“復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，生姜瀉心湯活性成分-UC 靶點關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)存在338 個節(jié)點與2 416 條關(guān)系。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果見圖3。在STRING 數(shù)據(jù)庫檢索得到171 個交集重疊蛋白，并生成一個復(fù)雜的PPI 網(wǎng)絡(luò)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果見圖4A。Cytohubba 分析PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重疊蛋白，發(fā)現(xiàn)AKT1、TP53、EGFR、HIF1A、JUN、CTNNB1、CASP3、IL-1β 和STAT3 等蛋白具有更高的重疊程度。見圖4B。根據(jù)拖拓?fù)鋮?shù)（6 個參數(shù)，包括Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC 和Network）排序，最終確定AKT1、TP53、IL-1β 為核心靶點。

圖4 交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對接驗證見圖5。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中活性成分Degree 值和Cytohubba 分析，采用分子對接分析姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素與AKT1、TP53 和IL-1β 蛋白間的結(jié)合。結(jié)果顯示，姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素與AKT1 蛋白穩(wěn)定結(jié)合，結(jié)合親和力分別為-4.1 kJ/mol、-4.8 kJ/mol、-4.0 kJ/mol、-4.5 kJ/mol 和-5.7 kJ/mol；同樣，IL-1β 蛋白與姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素化合物也顯示出穩(wěn)定結(jié)合，其結(jié)合力分別為-3.3 kJ/mol、-3.1 kJ/mol、-3.4 kJ/mol、-1.4 kJ/mol 和-2.0 kJ/mol；此外，柚皮素與TP53 活性殘基的結(jié)合力最強(qiáng)，其次是漢黃芩素、山柰酚、姜烯酮A 和槲皮素。

圖5核心分子對接模擬圖

2.6 各組細(xì)胞活性比較見圖6A。在無LPS 刺激的條件下，生姜瀉心湯提取物濃度在大于100 μg/mL時，能顯著降低Caco2 細(xì)胞活性（P＜0.05）。見圖6B。在LPS（1 μg/mL）刺激下，生姜瀉心湯提取物在濃度范圍25、50、100 μg/mL 能夠顯著地抑制LPS刺激引起細(xì)胞活性下降（P＜0.05）；而當(dāng)生姜瀉心湯濃度200、400 μg/mL，能顯著降低細(xì)胞活性（P＜0.05）。

圖6 各組細(xì)胞活性比較

2.7 各組細(xì)胞AKT1、TP53、IL-1β mRNA 表達(dá)水平比較見圖7。與Ctrl 組比較，LPS 組AKT1、TP53 和IL-1β mRNA 水平均升高（P＜0.05）；與LPS組比較，生姜瀉心湯50、100 μg/L 干預(yù)后，AKT1、TP53 和IL-1β mRNA 的表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖7 各組細(xì)胞AKT1、TP53、IL-1β mRNA 表達(dá)水平比較

2.8 各組細(xì)胞AKT1、TP53、IL-1β 蛋白表達(dá)水平比較見圖8。與Ctrl 組比較，LPS 組AKT1、TP53和IL-1β 蛋白表達(dá)水平均上調(diào)；與LPS 組比較，100 μg/mL 生姜瀉心湯干預(yù)后，生姜瀉心湯組AKT1、TP53 和IL-1β 蛋白表達(dá)水平明顯下降。

圖8 各組細(xì)胞AKT1、TP53、IL-1β 蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

本研究基于中藥復(fù)方多成分、多靶點作用的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對生姜瀉心湯的有效成分進(jìn)行篩選，結(jié)合UC 的發(fā)病機(jī)制，預(yù)測其治療UC 的關(guān)鍵靶點和信號通路，并對關(guān)鍵靶點進(jìn)行驗證。首先，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，篩選出生姜瀉心湯治療UC 的有效成分171 種，核心有效成分包括姜烯酮A、槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素等。研究中獲得生姜瀉心湯治療UC 的可能作用靶點，通過PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選及拓?fù)浞治鲎罱K獲得HIF1A、STAT3、CTNNB1、CASP3、AKT1、IL-1β、TP53、EGFR、JUN 共9 個核心基因，其中AKT1、IL-1β 和TP53 起關(guān)鍵作用。前期大量的研究也已經(jīng)證明AKT1、IL-1β 和TP53 基因在UC 發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10-12]。進(jìn)一步采用分子對接驗證結(jié)果顯示，生姜瀉心湯中核心成分和關(guān)鍵靶點的親和力高，說明生姜瀉心湯可能作用于以上靶點（AKT1、IL-1β 和TP53）治療UC。

為了進(jìn)一步驗證生姜瀉心湯可通過調(diào)控AKT1、IL-1β 和TP53 靶點治療UC。本研究采用生姜瀉心湯干預(yù)LPS 刺激Caco2 細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，生姜瀉心湯能夠劑量依賴性地抑制AKT1、IL-1β 和TP53 mRNA 的表達(dá)；同時，免疫熒光分析也同樣表明生姜瀉心湯能夠明顯地下調(diào)AKT1、IL-1β 和TP53 蛋白的表達(dá)，提示生姜瀉心湯干預(yù)后能夠顯著地抑制LPS 刺激Caco2 細(xì)胞AKT1、IL-1β 和TP53 基因和蛋白的表達(dá)，再次證實生姜瀉心湯可通過調(diào)控AKT1、IL-1β 和TP53 等靶點，改善UC。

綜上，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建“復(fù)方-藥材-活性化合物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地對生姜瀉心湯中活性成分進(jìn)行研究，揭示中藥復(fù)方與UC 之間的關(guān)聯(lián)性。同時，通過分子對接技術(shù)和細(xì)胞實驗對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的部分預(yù)測結(jié)果進(jìn)行了驗證，為深入探究生姜瀉心湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制提供參考。