徐嗣亮，夏心如，蔣春艷，錢易，李梅，馬翔，刁飛揚，劉嘉茵，高彥

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心,南京 210029)

卵巢儲備功能減退(diminished ovarian reserve,DOR)會導致女性生育能力下降,行體外受精或卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)助孕是常見的治療方案。相較于控制性卵巢刺激(controlled ovarian stimulation,COS)的常規(guī)促排卵方案,自然周期具有可多周期連續(xù)取卵、新鮮周期可移植、縮短受孕等待時間等優(yōu)勢,每移植周期臨床妊娠率與常規(guī)誘導排卵方案相似,卻極大的減輕了患者的經(jīng)濟負擔,對DOR、常規(guī)COS卵巢反應不良或不宜常規(guī)COS的患者(比如卵巢交界性腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病患者),自然周期是一個值得推薦的方案[1-2]。然而,自然周期的卵泡生長規(guī)律較難掌握,卵母細胞提早排逸現(xiàn)象較為普遍,周期取消率較高。因此,自然周期中對卵泡的監(jiān)測、扳機和取卵時機的把握值得深入研究。

本研究選取2020年1月至2023年4月期間在南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心接受自然周期方案IVF/ICSI助孕的815名DOR患者,收集其臨床資料進行回顧性研究,探究DOR患者采用自然周期助孕中影響卵母細胞提前排逸的因素,并進一步比較采用自然周期的DOR患者扳機后提前及正常取卵的治療結局,從而評估提前取卵是否可以使有卵母細胞早排高風險的人群獲益。

資料與方法

一、研究對象及分組

本研究采用回顧性隊列研究的方法,分析2020年1月至2023年4月期間在本中心接受IVF/ICSI-ET助孕的815名DOR患者的臨床資料。

納入標準:(1) 符合博洛尼亞標準(Bologna Criteria):既往常規(guī)促排卵卵巢低反應(≤3個卵母細胞);竇卵泡數(shù)(AFC)<5～7個或抗苗勒管激素(AMH)<0.5～1.1 ng/ml;年齡>40歲,或存在其它損傷卵巢功能的危險因素,如卵巢手術、遺傳缺陷、放化療、自身免疫性疾病等。以上3條中有2條即為卵巢功能減退;(2)采用自然周期方案;(3)均有卵泡發(fā)育。

排除標準:(1) 夫妻雙方任一方染色體異常;(2)夫妻雙方任一方患嚴重內外科疾病;(3) 宮腔重度粘連及子宮畸形;(4)卵泡生長和雌激素水平不匹配,周期取消者。

根據(jù)取卵日卵母細胞是否提前排逸分為A、B兩組:A組為取卵日卵母細胞未早排組(712個周期),B組為取卵日卵母細胞早排組(103個周期)。再根據(jù)扳機后取卵時間將A、B兩組細分:扳機日血LH<20 U/L時扳機后36 h取卵,即A1(n=608)和B1組(n=90),若扳機日血LH≥20 U/L時扳機后24 h取卵,即A2(n=104)和B2組(n=13)。

二、研究方法

1.卵泡監(jiān)測及扳機時機:所有DOR患者在月經(jīng)第3天,經(jīng)陰道B超檢測雙側卵巢的竇卵泡大小和數(shù)量,同時檢測血清基礎卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)及雌二醇(E2)水平。當卵泡直徑>14 mm時,開始監(jiān)測血LH、E2、孕激素(P)水平。當優(yōu)勢卵泡直徑>15 mm且每個優(yōu)勢卵泡E2水平達到800～1 100 pmol/L時皮下注射0.1 mg促性腺激素釋放激素激動劑(達菲林;益普生,法國)或6 500 U重組人絨促性素(艾澤;默克,意大利)扳機,扳機日起每晚使用消炎痛栓100 mg納肛至取卵日。

2.取卵:扳機日血LH<20 U/L時,于當天20:00給予皮下注射0.1 mg促性腺激素釋放激素激動劑(達菲林)或6 500 U重組人絨促性素(艾澤)誘發(fā)排卵,注射后36 h取卵;若扳機日血LH≥20 U/L,則當天12:00扳機,注射后24 h取卵。取卵時用19G單腔針(COOK公司,澳大利亞),反復沖洗≤6次。

3.胚胎評分:授精17～18 h后觀察到兩個原核(2PN)及兩個極體(2PB)即為正常受精,按照Veeck卵裂期胚胎評分標準,依據(jù)授精72 h后胚胎的卵裂球數(shù)目、細胞質均一性、發(fā)育速度及碎片率等進行分級。其中卵裂球數(shù)目≥7個、碎片≤10%的胚胎為優(yōu)質胚胎;卵裂球數(shù)目≥4個、碎片≤15%的胚胎為Ⅲ級以上可移植胚胎;卵裂球數(shù)目<4個、碎片>15%的胚胎為Ⅳ級廢棄胚胎。囊胚評分采用Gardner評分系統(tǒng),4CC以上的囊胚認為是可利用囊胚,4BB以上的囊胚為優(yōu)質囊胚。所用培養(yǎng)液均由美國Cook公司提供。

4.胚胎移植及黃體支持:自然周期多進行新鮮周期移植。若扳機日內膜厚度≥8 mm 且分型為A型或A-B型,則受精后第3天進行胚胎移植或培養(yǎng)至第5天進行囊胚移植;內膜厚度在6～8 mm 時,口服戊酸雌二醇(補佳樂;拜耳醫(yī)藥,德國)至內膜厚度達 8 mm 以上;若內膜厚度過薄(<6 mm)時,則胚胎進行玻璃化冷凍保存,然后等待下一周期的凍融胚胎移植(FET)。移植后常規(guī)地屈孕酮片(達芙通;蘇威制藥,荷蘭)20 mg/d口服和/或黃體酮軟膠囊(安琪坦;CyndeaPharma,西班牙)200 mg bid陰道用藥進行黃體支持。注:本研究中新鮮周期移植的胚胎僅為本周期取卵后培養(yǎng)形成的胚胎,FET 周期僅移植單次取卵周期獲得的胚胎,無多周期胚胎混合移植,且移植周期均為單胚胎移植。

5.妊娠結局判定:移植14 d后監(jiān)測血清人絨毛膜促性腺激素(β-HCG),若β-HCG>5 U/L 繼續(xù)黃體支持;移植30 d后B超檢查宮內見孕囊及心管搏動,可確定臨床妊娠,黃體支持至妊娠10周逐漸減藥,妊娠12～13周停藥。

6.觀察指標:正常受精率(出現(xiàn)2PN 及2PB卵母細胞數(shù)/獲卵數(shù)×100%)、卵裂率(2PN卵裂數(shù)/2PN數(shù)×100%)、胚胎形成率(胚胎形成個數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%)、囊胚形成率(囊胚形成個數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)×100%)、優(yōu)質胚胎率(優(yōu)質胚胎數(shù)/可移植胚胎數(shù)×100%)、無可移植胚胎周期率[(未獲卵+未授精+未受精+未卵裂+無可移植胚胎周期)/取卵周期數(shù)×100%]、全胚冷凍率(全部胚胎冷凍周期/獲可移植胚胎周期數(shù)×100%)、鮮胚移植率(取卵周期移植胚胎周期數(shù)/獲可移植胚胎周期數(shù)×100%)、未獲卵率(1-穿刺獲得的卵母細胞數(shù)/穿刺的卵泡數(shù))、HCG陽性率(HCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)、臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)、流產(chǎn)率(流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)、異位妊娠率(異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)、活產(chǎn)率(活嬰出生周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)、早產(chǎn)率(孕37周前活嬰出生周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)×100%)、多胎率(多胎妊娠周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)×100%)、低體重兒出生率(出生體重小于2 500 g活產(chǎn)嬰兒周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)×100%)、巨大兒出生率(出生體重大于4 000 g 活產(chǎn)嬰兒周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)×100%)、累積活產(chǎn)率(新鮮周期+凍融周期移植獲得活產(chǎn)的周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%),累積臨床妊娠率(新鮮周期+凍融周期移植獲得臨床妊娠的周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%)。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、患者一般情況比較

本研究共納入815個自然周期IVF/ICSI-ET治療周期,各組間患者年齡、BMI、AMH、基礎FSH水平及月經(jīng)周期天數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(表1)。

表1 患者一般情況比較[(-±s),M(P25,P75)]

二、相同取卵時間下早排組與非早排組患者的促排卵情況

扳機36 h后取卵的患者,取卵日卵母細胞未早排組(A1組)與取卵日卵母細胞早排(B1組)組相比,取卵周期起始第3天的最大卵泡直徑和激素(FSH、LH、E2)水平以及扳機藥物種類差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);A1組患者扳機日每個卵泡E2水平、LH水平及P水平均顯著低于B1組(P均<0.05)(表2)。

表2 扳機36 h后取卵的早排和非早排患者的促排卵情況比較[(-±s),M(P25,P75)]

扳機24 h后取卵的患者,A2組(取卵日卵母細胞未早排)與B2組(取卵日卵母細胞早排)相比,當取卵周期第3天的最大卵泡直徑和激素(FSH、LH、E2)水平以及扳機藥物種類差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);A2組患者扳機日每個卵泡E2、LH及P水平均較 B2組為低,但差異尚沒有統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(表3)。

表3 扳機24 h后取卵的早排和非早排患者的促排卵情況比較[(-±s),M(P25,P75)]

三、扳機日LH水平對自然周期卵母細胞早排的預測價值

由于扳機日患者的激素水平不同,應用ROC曲線評價扳機日LH及P水平對預測自然周期卵母細胞早排的價值。統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn):扳機日LH水平預測早排的ROC曲線下面積(AUC)為0.714[95%CI(0.668,0.760)],截斷值為13.745 U/L,對應的敏感性82.40%,特異性59.30%,約登指數(shù)為0.417;扳機日P水平預測早排AUC為0.580[95%CI(0.519,0.640)]截斷值為2.71 nmol/L,對應敏感性為29.3%,特異度為85.9%,約登指數(shù)為0.141。ROC曲線分析結果顯示,扳機日LH水平對卵母細胞早排有一定預測價值,而扳機日P水平的預測價值欠佳。

四、卵母細胞未早排的正常取卵與提前取卵組間臨床數(shù)據(jù)、妊娠結局及分娩結局比較

卵母細胞早排組由于在取卵日當天卵母細胞已經(jīng)排出,B組患者沒有取卵,故沒有相應的臨床妊娠情況及分娩情況。統(tǒng)計比較卵母細胞未早排的患者的相關數(shù)據(jù)顯示:扳機后36 h正常取卵的A1組患者,其扳機日LH及P水平顯著低于24 h提前取卵的A2組,而A1組患者的受精率、卵裂率均顯著高于A2組(P<0.05),A2組的無可移植胚胎率高于A1組,而兩組間的未獲卵率、胚胎形成率、優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率、全胚冷凍率、鮮胚移植率差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(表4)。

表4 卵母細胞未早排DOR患者不同時間取卵組間的受精及胚胎培養(yǎng)結局比較[(-±s),%]

新鮮周期中,A1、A2兩組間的HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);其中,受樣本量所限,A2組異位妊娠率、早產(chǎn)率、巨大兒出生率、低體重兒出生率為0(表5)。進一步計算累積妊娠結局發(fā)現(xiàn),A1組的累積HCG陽性率、累積臨床妊娠率、累積活產(chǎn)率均顯著高于A2組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表6)。

表5 卵母細胞未早排DOR患者不同時間取卵組間的胚胎移植情況比較(%)

表6 卵母細胞未早排DOR患者不同時間取卵組間的累積妊娠結局比較(%)

獲卵后培養(yǎng)若形成可移植胚胎且內膜達標,則進行鮮胚移植。本研究中,卵母細胞未早排兩組(A1、A2)中共有255個周期進行了鮮胚移植,其中46個周期獲得臨床妊娠,其余209個周期未獲臨床妊娠。分組比較后發(fā)現(xiàn)臨床妊娠組患者的年齡顯著低于未臨床妊娠組(P<0.001),而兩組患者間的AMH、BMI、扳機日E2、P、LH水平、提前取卵周期的占比以及移植優(yōu)質囊胚率,差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),雖然臨床妊娠組的移植優(yōu)質卵裂胚率、移植囊胚率較未臨床妊娠組為高,但差異尚未達統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(表7)。

表7 卵母細胞未早排患者鮮胚移植周期臨床數(shù)據(jù)比較[(-±s),M(P25,P75),%]

討 論

1978年,世界首例“試管嬰兒”通過自然周期體外受精(natural cycle in vitro fertilization,NC-IVF)技術成功妊娠分娩。但自然周期每取卵周期僅能獲得1枚卵母細胞。隨著促排卵方式的出現(xiàn),使每取卵周期可獲得多個卵母細胞,進而形成多枚胚胎,從而提高了輔助生殖技術助孕的成功率。但是,大劑量促性腺激素刺激的過程造成非生理狀態(tài)的高雌、孕激素環(huán)境,不僅明顯增加了卵巢過度刺激綜合征等促排卵并發(fā)癥的風險,還具有溶黃體毒性[3];同時,過量募集卵泡增加耗氧量,在一定程度上打破了卵巢的氧化應激平衡,促使卵母細胞減數(shù)分裂、發(fā)育潛能和表觀遺傳修飾異常,核胞漿成熟不同步,導致受精異常、胚胎非整倍體率升高,流產(chǎn)率增加,顯著增加了產(chǎn)科不良生育結局[4]。促排卵中高劑量促性腺激素對高齡DOR患者影響尤甚[5-6]。近年來,越來越多的學者提出對DOR患者采用自然周期方案,以減少卵泡發(fā)育過程中氧化自由基的產(chǎn)生,通過無干擾的自然選擇,募集周期中最優(yōu)質的卵母細胞,以期提高所獲卵母細胞的質量[1]。自然周期雖然取消率高,但因其更接近生理狀態(tài),一旦獲得可移植胚胎,其移植后的妊娠率及活產(chǎn)率均高于常規(guī)誘導排卵周期,早產(chǎn)兒及低出生體質量兒率均明顯下降,產(chǎn)科結局明顯改善[7]。同時,自然周期方案可多周期連續(xù)取卵,并發(fā)癥風險低,且監(jiān)測簡單、減少了患者的痛苦和經(jīng)濟負擔。對于高齡DOR、既往多次誘導排卵卵巢低反應或因罹患免疫系統(tǒng)疾病、卵巢交界性腫瘤而不適宜常規(guī)誘導排卵的患者,自然周期取卵是一種有前景的治療方法[8-9]。然而,自然周期的卵泡生長規(guī)律較難掌握,LH峰提前出現(xiàn)增加了卵母細胞提早排出的風險,導致自然周期取消率高[10-11]。探尋預測卵母細胞在取卵前早排的臨床指標,可以成為預防卵母細胞早排和規(guī)劃取卵時間的重要依據(jù)[12-13]。

隨著卵泡直徑增大,卵泡顆粒細胞分泌的E2增多,卵泡成熟時形成的E2峰正反饋刺激垂體分泌LH,內源性LH峰誘發(fā)排卵及卵泡黃素化,P隨之升高。LH的升高預示卵母細胞提前排逸的可能,是臨床上極為關注的節(jié)點[14-15]。我中心既往研究數(shù)據(jù)顯示,自然周期LH≥20 U/L時,卵母細胞取卵前提早排出率達26.09%;當LH≥30 U/L時,卵母細胞取卵前提早排出率高達72.73%[12]。本研究運用ROC曲線分析再次證實了扳機日LH水平對卵母細胞早排有較好的預測價值,并提示當LH≥13.745 U/L時就需要警惕卵母細胞提前排逸的發(fā)生。雖然經(jīng)ROC曲線分析,扳機日P水平對預測卵母細胞早排的敏感性及特異性欠佳,但P水平的增高會通過改變子宮內膜基因的表觀遺傳修飾、黏附因子表達及免疫狀態(tài)損害子宮內膜容受性,引起子宮內膜窗口期提前,最終降低ART鮮胚移植的妊娠率、增加流產(chǎn)率[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),采用自然周期方案助孕的高齡DOR患者,未獲臨床妊娠組患者的扳機日P水平雖高于臨床妊娠組,但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05),而臨床妊娠組患者的年齡顯著低于未獲臨床妊娠組(P<0.05)。同時,提前取卵的未早排組,雖然扳機日LH及P水平均顯著高于正常取卵的未早排組,但兩組的鮮胚移植周期的HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),以上結果均提示相較于扳機日P水平,年齡才是高齡DOR患者鮮胚移植周期臨床妊娠率的絕對影響因素。后期需要進一步擴大樣本量評估扳機日不同P水平對卵母細胞早排及后續(xù)鮮胚移植結局的影響,探尋更有臨床應用價值的預測指標。

與扳機日LH、P水平升高而進行搶救性取卵相比,我們更希望在扳機日之前,特別是在周期的起始階段就能夠預測本周期卵母細胞早排的風險。本研究發(fā)現(xiàn)取卵日卵母細胞早排與患者年齡、BMI、基礎FSH值、月經(jīng)周期天數(shù)無關。本研究將取卵周期第三天(即本取卵周期起始狀態(tài)下)的卵泡大小、FSH、LH、E2水平納入研究,仍沒有發(fā)現(xiàn)取卵周期初始階段上述指標對卵母細胞早排具有預測價值。因此,在自然周期取卵當月的啟始階段,尚缺乏有效的預測指標可以預測卵母細胞提前排逸的風險。優(yōu)勢卵泡形成后監(jiān)測激素水平仍然是判斷卵母細胞早排的可靠指標。在臨床上,扳機日出現(xiàn)LH、P水平過高者,可采用GnRH拮抗劑或者非甾體類抗炎藥(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs,NSAIDs)預防卵母細胞早排,同時可以提前取卵來降低周期取消的風險[18-20]。

本研究進一步比較了提前取卵與正常取卵人群的獲卵情況、胚胎結局及妊娠結局后發(fā)現(xiàn),雖然2組間的未獲卵率、胚胎形成率、優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率、鮮胚移植率、全胚冷凍率的差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),但是因為扳機日LH水平升高從而提前取卵的患者的受精率及卵裂率顯著降低,無可移植胚胎率顯著升高,且正常取卵組累積HCG陽性率、累積臨床妊娠率、累積活產(chǎn)率均高于提前取卵組(P均<0.05)。在本研究中,提前取卵人群臨床結局不理想,可能與LH峰提前出現(xiàn),卵母細胞胞質及胞核成熟不同步導致有效胚胎率下降有關[15,21]。本研究結果提示在臨床上應盡量避免提前取卵。對于扳機日激素水平提示卵母細胞可能提前排逸的人群,為了防止卵母細胞早排而提前取卵可能并不能顯著改善臨床結局,反而加重了患者的經(jīng)濟負擔和心理壓力。

綜上所述,自然周期方案對于高齡DOR患者是一種有效、合理、低成本、低風險的助孕方式。但自然周期中內源性LH峰值的出現(xiàn)時機難以預測,個體差異較大,缺乏準確的參考標準,給臨床工作帶來不便。對于扳機日LH、P升高,有卵母細胞提前排逸可能的高風險人群,提前取卵并不能顯著改善患者的助孕結局。對于不存在男方因素,輸卵管通暢,可正常排卵的人群,如果在卵母細胞成熟時出現(xiàn)了早發(fā)LH峰及P升高,可以指導患者試孕;對于存在輸卵管或男方因素,或因無卵泡發(fā)育反復取消周期、卵母細胞極其珍貴的患者,也可以選擇扳機后提前取卵,以增加獲卵機會。在取卵前使用GnRH拮抗劑或NSAIDs以抑制卵母細胞早排、降低周期取消率;對于無自然受孕可能的人群,如果排卵后存在3枚及以上直徑小于8 mm的竇卵泡,可以酌情選擇黃體期促排卵以增加獲卵數(shù)目。需要注意的是,本研究由于納入病例數(shù)有限,且為回顧性研究,難以完全避免數(shù)據(jù)偏倚對研究結果的干擾,還需要多中心、隨機對照試驗進一步證實觀點的有效性。在未來的研究和工作中,需要通過細致的觀察和摸索,尋找有效預測卵母細胞提前排逸的因素,準確把握LH峰值出現(xiàn)的前兆,盡量避免不成熟卵母細胞的提早排出及非必要的提前取卵,提高卵母細胞成熟度和優(yōu)質胚胎率,最終改善臨床妊娠結局。