成桂紅，杜天奇，李惠敏，吳惠華，王馥新，孟慶霞

(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心,蘇州 215002)

卵巢組織冷凍與移植作為保存女性生育能力的一種新興技術(shù),可為年輕女性惡性腫瘤、卵巢早衰及嚴重的子宮內(nèi)膜異位癥的患者保留生育能力。目前我國已有第一例卵巢組織冷凍移植后的寶寶在北京誕生,該女嬰母親凍存了6 塊卵巢皮質(zhì)組織,移植后27 個月自然妊娠[1-2]。卵巢組織移植過程中的缺血性損傷是影響移植物存活及加速卵泡閉鎖致卵泡耗竭的主要原因,因此如何減少缺血性卵泡損傷成為需解決的一大難題。目前,有研究報道應(yīng)用抗氧化劑[3]、抗凋亡劑[4]、干細胞[5]、3D卵巢[6]及激素[7-8]等可以提高卵巢組織冷凍與移植后的卵泡存活率。近年來,研究者們開展了關(guān)于干細胞的研究,我們將在本綜述著重介紹不同組織來源的干細胞改善卵巢組織冷凍與移植后卵泡存活的研究進展及其機制,并展望在生育力保存尤其是卵巢組織冷凍移植中的臨床應(yīng)用前景。

一、干細胞改善卵泡存活的機制及研究進展

1.間充質(zhì)干細胞(MSCs):間充質(zhì)干細胞可分化為三個胚層,具有參與組織損傷修復的功能及抗炎、抗氧化、抗凋亡等特性。

(1)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC):近年相關(guān)研究顯示,BMSC可以通過自分泌或旁分泌的機制促進凍融卵巢組織自體移植的卵泡發(fā)育及卵巢功能恢復。Xia等[9]將MSCs與卵巢皮質(zhì)組織移植,推測MSCs可能通過分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細生長因子2(FGF2)、血管生成素(ANG)等血管生成因子,促進凍融卵巢組織移植物中新生血管持久生成,增加血液灌注進而減少原始卵泡凋亡。Zhang等[10]進一步使用細胞因子微陣列技術(shù)明確人卵巢組織共移植MSCs中與血管生成相關(guān)的關(guān)鍵特異性分泌因子--ANG,首次表明MSCs通過ANG介導異種移植人類卵巢組織中的血管生成和卵泡存活。此外,MSCs分泌血管生成因子還可誘導卵泡發(fā)育基因上調(diào),Hosseini等[11]將凍融人卵巢皮片組織片段與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)8 d,發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞可調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育相關(guān)基因生殖系a因子(FIGLA)、生長分化因子9(GDF9)、卵泡生成素受體(FSHR)及雌二醇(E2)的表達改善早期卵泡發(fā)育及存活,進而改善卵巢功能可改善人卵泡原位激活和冷凍卵巢組織的早期發(fā)育。

(2)臍帶血間充質(zhì)干細胞(UCMSC):UCMSC是一種對卵巢冷凍移植有顯著治療潛力的干細胞。Jia等[12]使用人UCMSC條件培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人凍融卵巢組織,發(fā)現(xiàn)早期卵泡發(fā)育、細胞增殖和E2分泌得到改善,凋亡細胞減少,并促進微血管生成,表明UCMSC具有細胞保護作用和較高的抗凋亡特性,首次發(fā)現(xiàn)MSCs促進體外培養(yǎng)系統(tǒng)中凍融卵巢的恢復,參與保護過程可能與其旁分泌活性有關(guān)。Xu等[5]使用Matrigel的簡單體外三維卵巢培養(yǎng)系統(tǒng)將凍融卵巢與干細胞共培養(yǎng),進一步表明UCMSC在體外卵巢培養(yǎng)系統(tǒng)中通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑促進凍融卵巢血管生成;缺氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞可以增強血管生成的潛力,Cheng等[13]將UCMSC置于缺氧培養(yǎng)箱(3%O2,37℃)中培養(yǎng)48 h進行缺氧預(yù)處理后與卵巢組織異種移植,通過PI3K/Akt/HIF 1a/VEGF/Akt信號通路途徑增加CD34、CD1和VEGFA的高表達促進早期血管生成,進而改善卵泡存活率;并顯著降低細胞凋亡,進而調(diào)節(jié)卵泡死亡,保護靜息的原始卵泡池,可能與HIF-1/VEGFA信號通路有關(guān)。以上MSCs對凍融卵巢的保護機制可能成為提高冷凍卵巢組織移植的治療策略。

(3)脂肪來源間充質(zhì)干細胞(ASCS):ASCS具有多譜系分化潛力、促血管生成特性以及增強異種移植人卵巢組織中血管形成的能力的作用[14],受到研究者的廣泛關(guān)注。Damous等[15]將ASCS注射到成年雌性Wistar大鼠新鮮移植的卵巢,發(fā)現(xiàn)較早恢復發(fā)情期和增加卵巢組織中血管數(shù)量,不導致細胞凋亡或細胞增殖,因此ASCS治療自體新鮮卵巢移植物可行且安全。邢彥彥等[16]研究也表明,大鼠卵巢自體移植過程中應(yīng)用ASCS可改善大鼠卵巢自體移植效果,提高移植效率。然而直接注射ASCS至凍融移植物會造成細胞損失,并可能損害已脆弱的組織。近年來,細胞治療已與組織工程技術(shù)相關(guān)聯(lián),以增強細胞在靶組織中的釋放和保留。Damous等[17]將明膠凝膠泡沫海綿作為大鼠凍融卵巢自體移植物中ASCS治療的支架,發(fā)現(xiàn)體外與干細胞共培養(yǎng)可保持干細胞活力長達5 d,使促血管生成因子的緩慢持續(xù)釋放達到治療水平;體內(nèi)可以促進大鼠雌孕激素恢復,且不干擾卵巢卵泡、纖維化、細胞凋亡或細胞增殖的數(shù)量和活力,提出凝膠泡沫支架作為細胞支架可能是治療凍融卵巢自體移植物的ASC遞送的一種可行且安全的非侵入性技術(shù)。干細胞分泌組包含許多分子和生長因子,分泌組的使用可能是一種新的細胞治療方法[18]。Damous等[19]將大鼠ASCS分泌組注射至雙側(cè)自體移植凍融卵巢中,發(fā)現(xiàn)移植物形態(tài)學受損、卵泡數(shù)量減少和細胞凋亡增加,表明ASCS分泌組的無細胞治療加重了對缺氧的卵巢移植物缺血損傷,提示在卵巢移植中應(yīng)用分泌組要謹慎,未來需要更多的研究來評估所涉及的因素以及將分泌組應(yīng)用于支架中以優(yōu)化其使用的可能性。近年來,研究者們逐漸開展ASCS對異種凍融卵巢移植的研究。Manavella 等[20]將裝載ASC的纖維蛋白植入物與人卵巢組織異種共移植到嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠腹膜,發(fā)現(xiàn)ASC可分化為人內(nèi)皮細胞譜系,并增加血管內(nèi)皮生長因子的基因表達,進而改善卵巢組織血流灌注;Cacciottola等[21]發(fā)現(xiàn)使用異種凍融卵巢移植前14 d,將裝載ASCs的纖維蛋白支架移植到移植部位,可加快卵巢移植物再灌注以減輕缺氧相關(guān)反應(yīng),組織中的卵泡顯示出較低水平的HIF1信號通路的激活,并通過移植后血管內(nèi)皮生長因子的長期增加來維持;無論采用何種移植策略,氧化應(yīng)激相關(guān)的核因子紅系相關(guān)因子2及提示卵母細胞DNA損傷的8-羥基脫氧鳥苷均無顯著升高,未發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激相關(guān)損傷的證據(jù)。Cacciottola 等[22]將ASCS預(yù)處理的凍融人卵巢組織移植入裸鼠,發(fā)現(xiàn)ASCS通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑減少原始卵泡活化,并抑制Hippo通路抑制卵泡生長,最終保護原始卵泡池,對卵巢儲備產(chǎn)生積極影響。Damous 等[23]將凍融大鼠卵巢自體移植物經(jīng)ASC治療后,發(fā)現(xiàn)ASC在短時間內(nèi)不影響卵巢移植物形態(tài)和活力的情況下,促進了與細胞凋亡Capsase14和炎性細胞因子Cxcl6家族相關(guān)的基因的過度表達,但細胞凋亡和炎癥對移植物的長期影響有待進一步研究。因此,脂肪干細胞療法對于卵巢移植物的影響有可能是雙面性的,需進行長期評估獲得更全面的認知。

2.其他源性干細胞:除了MSCs在卵巢冷凍移植應(yīng)用較多以外,其他源性干細胞等也可改善移植后卵泡存活。Dalman等[24]將人冷凍保存的碎片卵巢組織與源自膜腔干細胞的人膜祖細胞(hTPCs)共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)卵泡顯著生長,卵母細胞中卵泡生成相關(guān)基因如透明帶糖蛋白(ZP1、ZP2、ZP3)和GDF9的表達、顆粒細胞中的AMH和膜細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)的表達均顯著增高,而細胞凋亡基因(Bax、Casp3和p53)的表達顯著較低,說明hTPCs在人類原始卵泡生長發(fā)育中有直接促進作用。極小胚胎樣干細胞(VSELs)在女性生殖系統(tǒng)中在發(fā)育上等同晚期遷移的原始生殖細胞,存在于成年性腺中,可為正?；蚴軗p的卵巢[25-26]提供間質(zhì)細胞來支持其功能,在腫瘤治療中因其靜止性質(zhì)存留下來并再生非功能性性腺,它的存在也解釋了卵巢皮質(zhì)組織移植后的自然妊娠[26]。Ebrahim等[27]研究表示,對于經(jīng)環(huán)磷酰胺化學消融受損的卵巢,骨髓來源的間充質(zhì)干細胞聯(lián)合促性腺激素治療通過增強極小胚胎樣干細胞恢復大鼠化學消融卵巢的出生后的卵子發(fā)生,VSELs產(chǎn)生未成熟的卵母細胞并抵抗化療。然而有研究表明VSEL樣干細胞作為潛在的原始胚胎干細胞產(chǎn)生的卵母細胞樣細胞與精子結(jié)合迅速釋放出透明帶樣結(jié)構(gòu),卻未產(chǎn)生受精現(xiàn)象[28],且部分可自發(fā)形成類似腫瘤樣結(jié)構(gòu)細胞簇并參與卵巢癌表現(xiàn),包括復發(fā)性卵巢癌伴腹水[29]。因此極小胚胎干細胞是干細胞促進卵泡新生的一個可能的新的研究方向,但是否能夠正常受精以及致癌性還是值得進一步研究。

二、臨床應(yīng)用與展望

干細胞通過各種機制對卵巢冷凍移植發(fā)揮治療作用,以上實驗研究共同表明它可促進凍融卵巢血管生成、恢復卵巢功能并激活卵泡,在未來卵巢冷凍移植中有著巨大的臨床應(yīng)用潛力。然而,就目前的研究現(xiàn)狀來看,干細胞想要實現(xiàn)臨床引用,仍有許多待解決的難題。第一,干細胞具有多分化潛能,有分化成惡性腫瘤細胞的風險;并且如何檢測移植組織中腫瘤細胞的存在及避免卵巢組織移植后癌細胞復發(fā)仍是臨床較大的難題。盡管已有動物實驗研究表明將完全緩解的白血病患者的冷凍保存卵巢皮層移植入裸鼠,20 周后未檢測到明顯的惡性細胞[30],但由于有引入疾病的風險,該方法的未來安全性需要開發(fā)有效的測試來檢測。第二,用干細胞改善卵巢組織冷凍與移植后造成的卵泡損傷,目前僅僅評估了其對移植物早期血管生成與卵泡恢復的作用,未來的研究應(yīng)評估這種治療對移植物存活和內(nèi)分泌活性的真正益處。但長期的效應(yīng)仍需要繼續(xù)進行實驗研究獲得更科學全面的認知。第三,對于干細胞新生卵泡是否可以進行正常受精并獲得妊娠,仍需要進行進一步的研究確認。第四,將卵巢組織移植引入臨床實踐需要解決許多問題,如凍融協(xié)議的標準化、選擇卵巢移植手術(shù)的時間等。目前2015年報道了在月經(jīng)初潮前冷凍保存的卵巢組織進行卵巢組織自體移植后成功恢復生育能力,并實現(xiàn)活產(chǎn),因此兒童期進行手術(shù)是可行的[31]。第五,移植技術(shù)的改進,如移植支架與組織的兼容性得到證實,2016年報道了有研究用人細胞外基質(zhì)支架對先前冷凍保存的卵巢組織使用機器人輔助微創(chuàng)手術(shù)微創(chuàng)移植移植后的首次妊娠及活產(chǎn)[32]。近年來有研究者使用無細胞支架以接種不同類型的干細胞用于卵巢修復及更安全地促進新生卵泡[33]。因此干細胞療法對于卵巢的影響有可能是雙面性的,需要全面提高干細胞的認知并進行實驗驗證其對冷凍卵巢的安全性及有效性,并在未來推廣至臨床疾病的治療。

干細胞療法可以保護原始卵泡、抗凋亡、激活卵泡,促進卵巢血管生成和功能恢復,將來有可能成為癌癥及卵巢早衰患者生育力保存的新選擇。但該技術(shù)對卵巢冷凍與移植的安全性以及長期效應(yīng)仍是未知的,并且干細胞用于卵巢組織低溫保存和移植尚未在人類臨床實施,將這些方法用于人類治療還需要進一步的研究。因此探索干細胞改善卵巢組織冷凍與保存的最佳安全方案及長期效應(yīng)仍是未來該領(lǐng)域的研究方向。