潘廣樂

（廣州市勝蔻生物科技有限公司，廣東 廣州 510990）

0 引言

精油類化妝品在經(jīng)過蒸餾、溶劑提取后，可濃縮獲取植物中多種人體有利成分和不利成分。植物精油的沸點(diǎn)范圍一般為150～300 ℃，其實(shí)際提取過程中會殘留一部分生物堿，其中有些生物堿具有一定毒性，如鉤吻堿、烏頭堿等，因而必須提高精油類化妝品安全問題的相關(guān)重視?，F(xiàn)有研究中針對化妝品中生物堿測定的研究成果較多，但相關(guān)成果大多集中在水劑、乳液膏類化妝品，對于精油類化妝品的研究則相對較少。因此，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對精油類化妝品中生物堿進(jìn)行檢測分析，介紹一種精油類化妝品中生物堿檢測方法，將具有一定研究價值。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀、超聲波清洗器、離心機(jī)、快速攪勻器、電子天平等。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

甲醇（色譜純，分析純）、乙腈（色譜純，分析純）、甲酸（LC-MS 級）、的寧、士延胡索乙素、雷公藤（次堿，吉堿）、青藤堿、秋水仙堿、山梗菜堿、阿托品、麻黃堿、鉤吻素子、黃華堿、西伐丁、那可丁、高三尖杉酯堿、東莨菪堿、山莨菪堿、馬錢子堿、倒千里光堿、蘆竹堿、新/次烏頭堿、毛果蕓香堿、苯甲酰/苯甲酰新/苯甲酰次烏頭原堿、麥角新堿、鉤吻素甲、氧化苦參堿、吳茱萸堿、哈爾堿、毒扁豆堿。

2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

31 種生物堿標(biāo)準(zhǔn)品用電子天平精確稱量，放入容量瓶中，用甲醇溶液將其分別定容，制成質(zhì)量濃度100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)樣品，并將其轉(zhuǎn)入褐色小瓶，在-20 ℃冷藏。

將標(biāo)樣溶液準(zhǔn)確地吸入后，將其放入容量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的甲醇溶液進(jìn)行稀釋和定容，制成質(zhì)量濃度為10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將該溶液轉(zhuǎn)入褐色小瓶，4 ℃低溫環(huán)境保存。

精確吸取10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用的甲醇-水溶液（體積比3∶1）稀釋，得到質(zhì)量濃度為2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)液。另外，吸取10 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用陰性空白基體萃取液進(jìn)行稀釋和定容，制得質(zhì)量濃度為2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L 的陰性標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 樣品前處理及實(shí)驗(yàn)條件

3.1 樣品前處理

所用的樣本都是市場上常用的植物精油。用電子天平精確步驟1.0 g 試樣，放入25 mL 帶塞比色管中，按3∶1 的體積比將包含2%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸溶液的甲醇-水溶液定容至10 mL。先用快速混合機(jī)進(jìn)行1 min 的混合，然后放入超聲波設(shè)備中萃取10 min，最后用吸管添加正己烷1 mL，用快速混合機(jī)處理5 min，除去樣本中的脂質(zhì)。將試樣放入離心機(jī)，在4 000 r/min 下離心10 min，移除正己烷層，將上清液用0.22 μm 有機(jī)濾膜濾出，用LC-MS/MS 對其進(jìn)行分析。

3.2 實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件：采用HPH-C18 色譜柱，試驗(yàn)中色譜柱溫度控制為35 ℃；色譜流動相A 采用體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸水溶液，色譜流動相B 采用乙腈，通過兩種流動相對色譜柱實(shí)施梯度洗脫，洗脫過程中流動相流速和進(jìn)樣量應(yīng)分別控制為0.35 mL/min、5 μL。

質(zhì)譜條件：實(shí)驗(yàn)過程中質(zhì)譜分析方法為正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測等；質(zhì)譜分析過程中儀器霧化壓力控制為276 MPa；設(shè)備干燥氣通入溫度為300 ℃，干燥氣流速控制為8 L/min；設(shè)備毛細(xì)管電壓控制為4 000 V。

4 結(jié)果與討論

4.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件優(yōu)化：考慮到生物堿中含有的N 原子上的孤電子易與質(zhì)子結(jié)合，所以實(shí)際質(zhì)譜正離子掃描時將采用一級質(zhì)譜掃描模式，完成掃描后選用分子離子為母體，實(shí)施二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)掃描結(jié)果選取2 個高豐度、低干擾的子離子作為實(shí)驗(yàn)中質(zhì)譜分析的定量和定性離子，以2 個離子為標(biāo)準(zhǔn)對二級質(zhì)譜進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，確保2 個離子響應(yīng)最大化，由此獲取相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)。

色譜條件優(yōu)化：根據(jù)現(xiàn)有研究成果（圖1）可知，相較于HPH-C18 色譜柱，Bonus-RP 色譜柱的總離子流色譜圖中存在多個包峰，說明色譜總體分離效果較差。具體分析后，確認(rèn)HPH-C18 色譜柱對部分生物堿的鍵合能力不足，以至于色譜柱分析中出現(xiàn)保留效果不足等情況。不過從整體角度來看，色譜柱分離后總離子流色譜圖的峰形較好，應(yīng)用此色譜柱后可有效增強(qiáng)色譜分析的總體分離度，因而綜合分析后選用HPH-C18 色譜柱作為色譜分析色譜柱。

圖1 HPH-C18 色譜柱對31 種生物堿總離子流色譜圖

4.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

提取溶劑優(yōu)化。分別采用甲醇和乙腈作為提取溶劑，對比分析后確認(rèn)相較于采用乙腈作為提取溶劑時，采用甲醇作為提取溶劑的響應(yīng)水平更高，因而選用甲醇作為提取溶劑。當(dāng)提取溶劑中的有機(jī)相為100%時，通過HPH-C18 色譜柱進(jìn)行色譜分析后發(fā)現(xiàn)色譜峰存在明顯前延情況，并且得到的色譜峰峰形較差。因此，在對比不同水與甲醇比例條件下樣品回收率以及色譜峰形變化后，確認(rèn)水與甲醇之間的體積比為1∶3 時，通過HPH-C18 色譜柱獲取的色譜峰峰形最好，因而將提取溶劑為水與甲醇體積比設(shè)置為1∶3。此外，在提取溶劑中加入適量的酸有利于增強(qiáng)生物堿的水溶性，所以在對比提取溶劑中加入不同量甲酸后，確認(rèn)最佳甲酸添加量為2%（體積分?jǐn)?shù)），此時提取溶液對各種生物堿均有著較高的回收率。

凈化條件優(yōu)化。精油類化妝品中蘊(yùn)含有較多的油脂類物質(zhì)，為保障精油類化妝品中生物堿測定精準(zhǔn)性，需要在樣品前處理過程中對油脂進(jìn)行有效去除。常用的油脂去除溶劑為正己烷，近年來部分學(xué)者采用EMR-Lipid 固相萃取小柱進(jìn)行油脂類物質(zhì)去除，為確認(rèn)兩種油脂去除方法的有效性，實(shí)施兩種方法對油脂去除效果對比，進(jìn)而獲取到圖2 中的對比分析結(jié)果。根據(jù)對比結(jié)果可知，相較于正己烷溶劑（HEX 除脂），EMR 固相萃取小柱（EMR 除脂）僅在去除含有5 個以上碳鏈的脂肪類物質(zhì)中表現(xiàn)出較好的成效，而精油類化妝品中不含有相關(guān)物質(zhì)，因而為有效降低測定成本，選用正己烷溶劑作為凈化溶劑。

圖2 兩種油脂去除方法的效果對比

4.3 基質(zhì)效應(yīng)的評價

基質(zhì)效應(yīng)通常會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度、靈敏度和準(zhǔn)確度。以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為測定樣品，選取陰性標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)軸，離子對峰面積為縱坐標(biāo)軸，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制相應(yīng)的基質(zhì)效應(yīng)曲線。目前已有多種方法可以對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評估，其中基質(zhì)效應(yīng)的研究主要是利用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的斜率與基體標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比進(jìn)行。一般認(rèn)為，SR=100%，不存在基體效應(yīng)；SR 值在80%～120%范圍內(nèi)（不包括100%），表明有微弱的基質(zhì)效應(yīng)；SR 值在50%～80%或120%～150%范圍內(nèi)，表明有中度基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)SR 值＜50%或＞150%時，表明有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。

通過對31 個生物堿類成分的分析，發(fā)現(xiàn)其中13%對香精油化妝品基質(zhì)的作用不大；有52%的生物堿具有中度影響；其中16%的生物堿具有中度影響；19%的生物堿類成分有較強(qiáng)的作用。雷公藤次堿、氧化苦參堿、苯甲酰/次/新烏頭堿等具有較強(qiáng)影響。因此，必須采取相應(yīng)的方法來消除基體的影響。常用的方法有兩種，一種是利用標(biāo)樣進(jìn)行校準(zhǔn)曲線修正，另一種是利用內(nèi)標(biāo)法對其進(jìn)行校正。

4.4 線性關(guān)系、檢出限與定量限

在保障色譜-質(zhì)譜條件最佳情況下，分別通過不同體積濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來測定31 種生物堿的離子對峰面積和質(zhì)量濃度，并將測定結(jié)果分別作為坐標(biāo)軸的縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo)，根據(jù)形成的坐標(biāo)軸獲取31 種生物堿的對應(yīng)回歸方程，相關(guān)回歸方程的線性相關(guān)性系數(shù)均處于0.992 9～1.000 0 區(qū)間。根據(jù)分析結(jié)果可知，31 種生物堿在其對應(yīng)的線性范圍內(nèi)均具備較好的線性關(guān)系。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度設(shè)定為2.5 μg/L，對31 種生物堿的檢出限范圍進(jìn)行分析計算，獲得對應(yīng)的檢出限區(qū)間為0.11～3.04 μg/kg，31 種生物堿的定量下限區(qū)間為0.33～1.13 μg/kg。

4.5 回收率與精密度

以陰性標(biāo)準(zhǔn)溶液為基底溶液，額外添加1 倍、2 倍、3 倍體積濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混合后用于加標(biāo)回收試驗(yàn)。通過三種濃度溶液分別開展加標(biāo)回收試驗(yàn)，各重復(fù)6 次，獲取6 次測試結(jié)果后計算每種生物堿的平均回收率均處于63.4%～126.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)差處于0.74%～16.81%。總體來說，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的回收率與精密度均可以滿足日常檢測標(biāo)準(zhǔn)要求。具體測定結(jié)果如表1 所示。

表1 31 種生物堿平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)差測定結(jié)果

4.6 實(shí)際樣品的檢測

隨機(jī)選取市面上20 種知名精油類化妝品進(jìn)行檢測，確認(rèn)所檢驗(yàn)的20 種化妝品均未檢測中上文中31 種禁用生物堿。同時，實(shí)驗(yàn)中樣品的加標(biāo)回收率均控制在69.2%～115.6%區(qū)間，確認(rèn)符合質(zhì)量控制要求。

5 結(jié)語

以LC-MS/MS 技術(shù)對31 種植物精油中31 種生物堿類成分進(jìn)行了測定，其中，以含2%甲酸的甲醇-水溶液（體積比為3∶1）為萃取劑，正己烷去油脂，HPH-C18 柱對31 個生物堿成分進(jìn)行高效分離，經(jīng)驗(yàn)證，該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，能滿足31 種植物精油化妝品中禁用生物堿的日常監(jiān)測需求。