張 瀟， 楊景鋒， 陳麗名， 李小會， 屈 杰

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)傷寒金匱教研室，咸陽 712046）

全球成年糖尿病患者達(dá)到5.37 億例，約有670 萬人死于糖尿病和糖尿病并發(fā)癥[1]。隨著糖尿病病程的延長，患者出現(xiàn)糖尿病微血管病變的概率逐步升高，其中糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是主要表現(xiàn)之一[2]，發(fā)生在約50%的糖尿病患者中[3]。DPN 臨床以遠(yuǎn)端對稱多發(fā)性感覺運(yùn)動神經(jīng)病變最為常見，且有25%的患者有痛覺異常，但目前關(guān)于疼痛感產(chǎn)生的機(jī)理尚未完全明確[4]。DPN 的發(fā)病率高，早期癥狀不明顯，嚴(yán)重者可造成不可逆的神經(jīng)損傷，是糖尿病患者致殘的主要原因之一[5]。

目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多以控制血糖、改善微循環(huán)、營養(yǎng)神經(jīng)、抗氧化等藥物治療DPN，但存在較多不良反應(yīng)且長期療效表現(xiàn)不佳[6]。中醫(yī)藥治療DPN 有一定的優(yōu)勢，中醫(yī)認(rèn)為DPN 屬于“消渴變證”，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸于痹癥、血痹等范疇[7]。其發(fā)病機(jī)制之一為氣虛血瘀，治療以益氣養(yǎng)血、活血化瘀為主[8]。抵當(dāng)芪桂湯是楊景鋒教授基于張仲景《傷寒雜病論》兩首著名方劑（黃芪桂枝五物湯、抵當(dāng)湯）化裁而來，組方為生黃芪、桂枝、炒白芍、酒大黃、鬼箭羽、水蛭，具有通絡(luò)降糖、益氣化瘀的作用[9]。楊景鋒等[10]通過常規(guī)劑量抵當(dāng)芪桂湯治療2 型糖尿病模型大鼠發(fā)現(xiàn)，其可以降低空腹血糖與血清游離脂肪酸（serum free fatty acid，F(xiàn)FA）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）含量，升高血清中脂聯(lián)素（adiponectin，ADPN）含量，進(jìn)而降低“糖脂毒性”，保護(hù)胰島β 細(xì)胞結(jié)構(gòu)。韓思榮等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抵當(dāng)芪桂湯治療2 型糖尿病大鼠能夠有效降低其血糖水平，保護(hù)胰島細(xì)胞，上調(diào)胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）表達(dá)，下調(diào)糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的水平。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從靶點基因?qū)用嫣剿鞯之?dāng)芪桂湯治療DPN 的作用機(jī)制，以期為臨床提供中藥治療DPN 的客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫的建立

TCMSP（https：//tcmsp.php），HERB（http：//herb.ac.cn/），UniProt（https：//www.uniprot.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/），PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/），TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/），DrugBank（https：//www.drugbank.com/），OMIM（https：//omim.org/），PDB（http：//www.rcsb.org/）。

1.2 抵當(dāng)芪桂湯活性成分與相應(yīng)靶點的篩選

利用數(shù)據(jù)庫TCMSP 得到黃芪、桂枝、白芍、大黃、鬼箭羽的活性成分，設(shè)篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-like，DL）≥0.18。利用數(shù)據(jù)庫HERB得到水蛭的活性成分（此數(shù)據(jù)庫無OB、DL 閾值）。將獲得的潛在活性成分，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫下載限制為Human 的相關(guān)基因數(shù)據(jù)，對抵當(dāng)芪桂湯的成分和靶點進(jìn)行整合及轉(zhuǎn)換基因名稱。

1.3 抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的相關(guān)疾病靶點

使用GeneCards、PharmGKB、TTD、DrugBank、OMIM 數(shù)據(jù)庫，以“Diabetic Peripheral Neuropathy”為檢索詞查找相關(guān)的疾病靶點。將藥物靶點和疾病靶點取交集，得到交集靶點。

1.4 藥物—成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

對藥物活性成分、靶點和疾病交集靶點進(jìn)行數(shù)據(jù)處理整合，并導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“藥物—成分—靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 軟件的NetworkAnalyzer 工作計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。

1.5 靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建及核心靶點的篩選

將獲得的藥物—疾病交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”進(jìn)行檢索，運(yùn)用Cytoscape 軟件中“CytoNCA”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治?，根?jù)其度值明確靶點間作用關(guān)系，進(jìn)行兩次核心靶點篩選，得到其核心靶點。

1.6 KEGG 通路富集分析和GO 富集分析

通過R 語言軟件把藥物—疾病靶點數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成基因序列號（ID），再進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析和基因本體（GO）富集分析。

1.7 活性成分—蛋白受體的分子對接

運(yùn)用PubChem 數(shù)據(jù)庫和Chem3D 軟件獲取藥物活性成分3D 結(jié)構(gòu)并最小化處理；運(yùn)用UniProt 數(shù)據(jù)庫和PDB 數(shù)據(jù)庫獲取靶點的蛋白結(jié)構(gòu)。運(yùn)用AutoDock 軟件進(jìn)行加氫和脫水等處理，再通過PyMOL 軟件進(jìn)行對接可視化。

2 結(jié)果

2.1 抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的相關(guān)疾病靶點

通過數(shù)據(jù)庫TCMSP 檢索抵當(dāng)芪桂湯藥物的活性成分為白芍10 個、大黃16 個、鬼箭羽8 個、桂枝7 個、黃芪20 個，通過數(shù)據(jù)庫HERB 得到水蛭的活性成分59 個（表1、表2）。剔除重復(fù)值后獲得藥物成分靶點共923 個。

表1 抵當(dāng)芪桂湯中的有效成分（藥材）

2.2 抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的關(guān)鍵靶點

通過GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫得到DPN 的疾病靶點，剔除重復(fù)值后獲得1 736 個，見圖1。疾病靶點與藥物靶點取交集得到214 個共同靶點，即抵當(dāng)芪桂湯所含藥物治療DPN 的潛在作用靶點，見圖2。

圖1 DPN 疾病靶點

圖2 抵當(dāng)芪桂湯藥物靶點與DPN 靶點交集

2.3 抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的藥物—成分—靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

對藥物活性成分、靶點和疾病靶點進(jìn)行數(shù)據(jù)整合，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的“藥物—成分—靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。網(wǎng)絡(luò)圖包括263 個節(jié)點（node），930 條邊（edge）。其中藥物活性成分排名前10 的是槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic acid）、D-甘露醇（D-mannitol）、山柰酚（kaempferol）、色氨酸（tryptophan）、肝素（heparin）、酪氨酸（tyrosine）、刺芒柄花素（formononetin）、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、棕櫚酸（palmitic acid）。

圖3 藥物—成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING 數(shù)據(jù)庫和CytoNCA 插件，以置信度為0.900 分析得到靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共有181 個節(jié)點、452 條邊，見圖4。運(yùn)用CytoNCA插件獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)核心，依據(jù)靶點節(jié)點度值的平均值進(jìn)行篩選，最終篩選得到SRC、STAT3、MAPK3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、JUN、TP53 和EP300等為核心靶點，見圖5。這些靶點在PPI 網(wǎng)絡(luò)中起連接作用，與抵當(dāng)芪桂湯的有效活性成分作用的發(fā)揮有著緊密的關(guān)系，可能成為治療DPN 的核心靶點。

圖4 抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的核心靶點圖

2.5 生物過程注釋及代謝通路分析

2.5.1 抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 關(guān)鍵靶點GO 富集分析 通過R 語言軟件以P<0.05 進(jìn)行篩選，排名前10 位的以GO 富集分析柱狀圖展示，見圖6。關(guān)鍵靶點涉及對脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)壓力的反應(yīng)、MAPK 級聯(lián)正調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對外源性刺激的反應(yīng)、激酶活性的正向調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)體液水平、對氧氣水平的反應(yīng)、對氧含量下降的反應(yīng)，以及應(yīng)對缺氧、對活性氧反應(yīng)等生物過程，主要集中在膜筏、膜微區(qū)、囊腔，分泌顆粒管腔、胞質(zhì)囊泡腔、質(zhì)膜外側(cè)、內(nèi)吞囊泡和黏著斑等部位，涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因素綁定、細(xì)胞因子受體結(jié)合及RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶綁定、核受體的活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、激素綁定等分子功能。

2.5.2 抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 關(guān)鍵靶點KEGG 通路富集分析 通過R 語言軟件以P<0.05 進(jìn)行篩選，排名前30 位的以KEGG 通路富集分析氣泡圖展示，見圖7。關(guān)鍵靶點涉及PI3K-AKT 信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、MAPK 信號通路、AGE-RAGE 信號通路在糖尿病并發(fā)癥、內(nèi)分泌抵抗、HIF-1 信號通路等相關(guān)通路。

圖7 KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.6 活性成分—蛋白受體的分子對接

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取核心藥物活性成分結(jié)構(gòu)并用Chem3D 軟件處理，運(yùn)用PDB 數(shù)據(jù)庫和UniProt 數(shù)據(jù)庫獲取基因靶點蛋白結(jié)構(gòu)。選取核心基因靶點SRC、STAT3、MAPK3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、JUN、CTNNB1、TP53 和EP300，與藥物活性成分槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic）、D-甘露醇（D-mannitol）、山柰酚（kaempferol）、色氨酸（tryptophan）、酪氨酸（tyrosine）、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）進(jìn)行分子對接。一般結(jié)合能≤-20.93 kJ·mol-1表示結(jié)合作用較好，≤-29.3 kJ·mol-1表示結(jié)合作用較強(qiáng)。對接結(jié)果見圖8，以對接結(jié)果排名前5為例進(jìn)行部分可視化展示，見圖9。

圖8 分子對接結(jié)合鍵能熱圖

圖9 活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接圖

3 討論

DPN 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，受多個基因及多條信號通路的調(diào)控。高血糖、脂代謝異常及胰島素抵抗等因素會誘發(fā)代謝通路的異常，如多元醇通路、蛋白激酶C 通路等；同時也導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的異常，如改變細(xì)胞內(nèi)線粒體的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基及糖基化終產(chǎn)物積聚等；而代謝通路和代謝產(chǎn)物的異常引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生的同時也會激活異常代謝通路，最終導(dǎo)致神經(jīng)受損[12]。DPN屬于中醫(yī)痿證、痹癥、不仁等范疇，其病機(jī)分為氣虛血瘀和痰瘀互結(jié)等[13]。本研究中抵當(dāng)芪桂湯君藥以黃芪補(bǔ)脾肺腎，益氣以行血；臣藥以桂枝溫通經(jīng)脈；佐以白芍養(yǎng)陰生津，補(bǔ)肝體以助肝用，使肝能疏泄以助脾之運(yùn)化；鬼箭羽、水蛭、大黃三藥并使，化瘀通絡(luò)兼祛濕濁[14]。諸藥合用，具有益氣化瘀、氣血同調(diào)、標(biāo)本兼治之功。針對氣虛血瘀的DPN 患者[9]，楊景鋒教授認(rèn)為2 型糖尿病周圍神經(jīng)病變的基本病機(jī)為氣虛血瘀，抵當(dāng)芪桂湯切中此病病機(jī)，臨床運(yùn)用此方加減治療糖尿病及其并發(fā)癥效果較好[15]。

網(wǎng)絡(luò)藥理是通過大數(shù)據(jù)進(jìn)行藥物分析的新模式，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測抵當(dāng)芪桂湯治療的靶點，可為抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的研究提供一定的理論依據(jù)。本研究除水蛭外，其余中藥均以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 的閾值為標(biāo)準(zhǔn)篩選活性成分，未達(dá)到閾值標(biāo)準(zhǔn)的活性成分未納入本次研究中。其中篩選得到抵當(dāng)芪桂湯活性化合物123個，預(yù)測藥物活性成分與DPN 的潛在共同靶點214 個。網(wǎng)絡(luò)圖提示抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的有效化合物為槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic acid）、D-甘露醇（D-mannitol）、山柰酚（kaempferol）、色氨酸（tryptophan）、肝素（heparin）、酪氨酸（tyrosine）、刺芒柄花素（formononetin）、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、棕櫚酸（palmitic acid）等。

山柰酚是一種黃酮類化合物，它及其衍生物具有抗炎、抗氧化和抗抑郁等作用，其中它對神經(jīng)的保護(hù)作用受到廣泛關(guān)注[16]。山柰酚可以抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和ROS 的產(chǎn)生，也可通過調(diào)節(jié)氧化和亞硝化應(yīng)激及抑制AGE-RAGE 的激活改善疼痛反應(yīng)，具有抗糖尿病，改善糖尿病神經(jīng)疼痛的作用[17]。熊果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，可以通過抗氧化和抗炎對抗神經(jīng)功能障礙，也可以降低蛋白酪氨酸磷酸酶1B，使胰島素受體磷酸化，從而誘導(dǎo)葡萄糖吸收[18]。熊果酸可以通過抗氧化和抗炎作用改善糖尿病的多種并發(fā)癥[19]。槲皮素是自然界的一種黃酮類化合物，同樣具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化、保護(hù)心血管、抗腫瘤的作用[20]。槲皮素能改善DPN 模型大鼠坐骨神經(jīng)中髓鞘中的脫髓鞘，糾正軸突萎縮，且增加了DPN模型大鼠中背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元，對高糖誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變具有神經(jīng)保護(hù)作用[21]。肝素是一種糖胺聚糖藥物，與多種蛋白結(jié)合后可以發(fā)揮抗炎、抗凝、抗腫瘤等作用[22]。有實驗研究[23]發(fā)現(xiàn)，基于肝素的水凝膠，可以更有效、安全地遞送神經(jīng)營養(yǎng)因子［神經(jīng)生長因子（NGF）和bFDF］共同到達(dá)坐骨神經(jīng)損傷的糖尿病大鼠中以增強(qiáng)受損的坐骨神經(jīng)髓鞘再生；軸突生長，出現(xiàn)周圍神經(jīng)再生。

本研究的關(guān)鍵靶點蛋白有MAPK14、MAPK1、AKT1、ESR1、SRC、EGFR、FOXO3、JUN、CTNNB1、IL6、TP53、STAT3、PIK3CA、EP300、MAPK3 和FOS。根據(jù)度值得到排名前10 的核心靶點為SRC、STAT3、MAPK3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、JUN、CTNNB1、TP53 和EP300。絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen activated protein kinase 3，MAPK3）是MAP 激酶家族的一員，也被稱為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1，MAPK3 參與多種細(xì)胞過程，包括增殖、炎癥和細(xì)胞代謝等，當(dāng)肝臟在空腹期間通過分解糖原和糖異生將葡萄糖釋放到循環(huán)中時，MAPK3 在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起主要作用[24]。STAT3 是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3。通過檢測神經(jīng)損傷誘導(dǎo)神經(jīng)疼痛性大鼠模型的背根神經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Janus 激酶2（JAK2）/STAT3 表達(dá)上調(diào)，磷酸化的STAT3 和JAK2 表達(dá)增強(qiáng)，且通過電針抑制背根神經(jīng)中的JAK2/STAT3 信號傳導(dǎo)后，神經(jīng)損傷誘發(fā)的神經(jīng)疼痛緩解[25]。腫瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）可誘導(dǎo)凋亡調(diào)節(jié)因子和糖酵解轉(zhuǎn)換途徑，降低ROS 水平，維持細(xì)胞內(nèi)氧還原，增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝[26]。研究[27]表明，TP53 在受損的神經(jīng)元中表達(dá)是升高的，但它的缺失可以抑制神經(jīng)元的凋亡。

GO 富集結(jié)果顯示，抵當(dāng)芪桂湯中的藥物作用于DPN 的靶點主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因素綁定、細(xì)胞因子受體結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能，其作用主要集中在膜筏、膜微區(qū)、囊腔，分泌顆粒管腔、胞質(zhì)囊泡腔、質(zhì)膜外側(cè)等部位，在對脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)壓力的反應(yīng)、MAPK 級聯(lián)正調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對外源性刺激的反應(yīng)等生物過程中發(fā)揮作用。

KEGG 通路富集結(jié)果提示，抵當(dāng)芪桂湯的作用靶點主要集中在PI3K-AKT 信號通路、MAPK信號通路、AGE-RAGE 信號通路在糖尿病并發(fā)癥、內(nèi)分泌抵抗和HIF-1 信號通路等。AGERAGE 信號通路的傳導(dǎo)導(dǎo)致NADPH、氧化酶、MAPK、蛋白激酶C 等多個細(xì)胞內(nèi)信號通路激活，促進(jìn)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6、Il-1β等多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致外周神經(jīng)元節(jié)段性脫髓鞘[28]。實驗研究[29]表明，通過抑制AGERAGE 減少氧化應(yīng)激，減少磷酸化的NF-κB，可以改善動物機(jī)械負(fù)荷引起的疼痛閾值，在動物坐骨神經(jīng)切片下觀察到，受藥物抑制AGE－RAGE信號治療的髓鞘神經(jīng)纖維受損傷程度小。PI3KAKT 信號通路參與多個生物過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、葡萄糖代謝等[30]，它的激活傳導(dǎo)促進(jìn)了糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)突生長[31]。MAPK 信號通路被激活作為很多信號通路傳導(dǎo)的反應(yīng)，且有研究調(diào)查MAPK 信號通路參與炎癥反應(yīng)，通過細(xì)胞實驗研究發(fā)現(xiàn)抑制MAPK 途徑可以使脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞中磷酸化的P38 和ERK 下調(diào)，達(dá)到抗炎的作用[32]。因此，抵當(dāng)芪桂湯的有效成分可以通過調(diào)控多個信號通路，參與多個生物過程，發(fā)揮治療DPN 的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了抵當(dāng)芪桂湯治療DPN 的化學(xué)成分、作用靶點及信號通路，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點、多通路的特點。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)存在一定局限性，在抵當(dāng)芪桂湯實際藥效、毒理性、量效關(guān)系等方面還需相關(guān)實驗研究加以驗證。