陳德勝， 王胤斌， 張晉寧， 楊天翔， 張博文， 郭鳳英， 李 燕

（1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，寧夏醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院，銀川 750002； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為主的伴有關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形及活動(dòng)障礙的慢性關(guān)節(jié)疾病，常見(jiàn)于負(fù)重關(guān)節(jié)[1-3]。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）發(fā)病率為8.1%[4]。KOA 并內(nèi)翻畸形是由于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝異常、軟骨基質(zhì)被破壞。關(guān)節(jié)的軟骨結(jié)構(gòu)中的鈣化層和軟骨下骨的改變?cè)贙OA 并內(nèi)翻畸形發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。本研究采用組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)，觀察KOA 并內(nèi)翻畸形的病理形態(tài)學(xué)，以期為KOA 并內(nèi)翻畸形的骨軟骨結(jié)構(gòu)改變的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年11 月1 日至2021 年10 月31日就診于寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院及寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的KOA 并內(nèi)翻畸形的55 例患者。其中，男性24 例，女性31 例；平均年齡（71.32±6.22）歲。收集患者經(jīng)人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)截骨去除的股骨內(nèi)外髁的骨及關(guān)節(jié)軟骨組織，用4%多聚甲醛固定為標(biāo)本。將55 例患者的股骨內(nèi)髁設(shè)為觀察組，股骨外髁設(shè)為對(duì)照組。標(biāo)本的收集均獲得患者及家屬的知情同意，獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（批準(zhǔn)號(hào)：2020-974）和寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院［批準(zhǔn)號(hào)：〔2022〕-LL-018］醫(yī)學(xué)倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：1）參照《中國(guó)骨關(guān)節(jié)炎診療指南（2021 年版）》[7]診斷為膝骨性關(guān)節(jié)炎的患者；2）年齡50～80 歲，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）18.0～31.5 kg·m-2；3）單側(cè)人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)均為患者初次手術(shù)；4）術(shù)前下肢血管超聲無(wú)深靜脈血栓；5）手術(shù)實(shí)施及病例隨訪均由同組醫(yī)師完成。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1）患有冠心病、腦血管疾病等手術(shù)禁忌證者；2）患有糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎者；3）近期有關(guān)節(jié)藥物注射史、止痛藥物服用史，有糖皮質(zhì)激素治療史，患有免疫性疾病者。

1.3 方法

1.3.1 手術(shù)方法 手術(shù)均由同組醫(yī)師完成。麻醉滿意后，采取膝前正中切口，繞髕骨內(nèi)側(cè)進(jìn)入關(guān)節(jié)內(nèi)入路；股骨側(cè)髓內(nèi)定位，定位桿入髓點(diǎn)在植入假體前用骨栓封閉，脛骨側(cè)髓外定位，植入膝關(guān)節(jié)表面置換假體，股骨與脛骨假體均采用骨水泥固定，髕骨關(guān)節(jié)面予以修整和去神經(jīng)化，術(shù)中關(guān)節(jié)腔及切口周?chē)半u尾酒”麻藥局部注射，放置切口引流。用紗布棉墊包扎。

1.3.2 大體形態(tài)觀察 行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中外翻髕骨，顯露后觀察股骨內(nèi)外髁與軟骨大體形態(tài)變化。采用截骨術(shù)去除骨與軟骨組織，采用相應(yīng)的固定液固定，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.3 蘇木素-伊紅（HE）染色 將切片置于37 ℃恒溫箱中過(guò)夜，分別經(jīng)過(guò)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min，無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ和95%、90%、80%、70%乙醇各5 min，水洗，入蘇木素染液染色10 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化3 s 后自來(lái)水沖洗，反藍(lán)20 min，伊紅染色1 min，分別置于95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫水透明，風(fēng)干后用中性樹(shù)脂封固，于顯微鏡下觀察。

1.3.4 番紅O-固綠染色 將組織切片于37 ℃烤箱中過(guò)夜，分別經(jīng)過(guò)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10 min，無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、不同濃度乙醇各5 min 脫蠟，加入新鮮配制的Weigert 染液3～5 min，1%氯化氫乙醇分化20 s，固綠染液內(nèi)浸染5 min，番紅浸染2 min，乙酸溶液漂洗1 min，不同乙醇脫水，風(fēng)干，二甲苯透明2 min，中性樹(shù)脂封固，于顯微鏡下觀察。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色 切片烤片、脫蠟、沖洗3 次；4 ℃的3% H2O2孵育30 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS 緩沖液沖洗3 次；然后將切片放入盛有PBS 緩沖液的收納盒中，置入煮沸的0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液煮15 min，再將收納盒放入0 ℃冰水混合物中降溫30 min，輔助抗原修復(fù)；PBS 緩沖液沖洗3 次后，滴加稀釋的羊血清封閉20 min，沖洗、擦干后，滴加一抗（兔抗人Osterix 單克隆抗體）孵育，4 ℃過(guò)夜。次日PBS 緩沖液沖洗擦干，滴加二抗（山羊抗兔IgG 聚合物）孵育，37 ℃孵育30 min，沖洗后DAB 顯色液顯色20 s，蘇木素復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗2 次，1%氯化鈉乙醇分化20 s，沖洗、脫水、透明后，中性樹(shù)脂封固。免疫組化結(jié)果應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件，觀察兩組軟骨細(xì)胞中Osterix 的平均光密度（OD）值，并進(jìn)行對(duì)比。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察 棄去西林瓶中的液體，更換為4 ℃預(yù)冷的1%鋨酸浸泡，置于4 ℃冰箱保存，2 h 后用0.1 mol·L-1二甲砷酸沖洗3次，不同濃度乙醇4 ℃脫水，不同濃度乙醇室溫下脫水，脫水完成后分別經(jīng)環(huán)氧丙烷、等比不完全包埋液和環(huán)氧丙烷混合液、2∶1 的不完全包埋液和環(huán)氧丙烷混合液滲透；完成滲透后再次加不完全包埋液室溫過(guò)夜。次日先置入完全包埋液浸泡后，分別經(jīng)35 ℃、42 ℃、60 ℃溫箱溫育。最后以臨界干燥法抽真空2 周，將干燥樣品黏附在金屬樣品臺(tái)上，使用噴鍍儀真空噴鍍5～6 min，于電子顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體形態(tài)觀察

觀察組股骨髁關(guān)節(jié)面不光滑，色澤灰暗，部分軟骨剝脫有軟骨下骨外露，股骨髁軟骨面缺損明顯，呈潰瘍狀，股骨髁多處外緣可見(jiàn)骨贅形成，軟骨下骨可見(jiàn)松質(zhì)骨硬化灶（圖1A）；對(duì)照組股骨髁軟骨面較光滑且平整，未見(jiàn)軟骨明顯缺失，軟骨表面色澤清亮、均勻，呈乳白色，股骨髁邊緣清晰，有少量骨贅生成（圖1B）。

圖1 股骨髁大體外觀照

2.2 HE 染色結(jié)果

光鏡下可見(jiàn)觀察組軟骨面凹凸不平，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)整，潮線紊亂，軟骨下骨質(zhì)部分異常增厚，可見(jiàn)血管翳從潮線通過(guò)，關(guān)節(jié)軟骨被侵蝕和破壞，潮線不完整，軟骨下骨出現(xiàn)彌漫性局灶增生現(xiàn)象，不同組織分層界線消失（圖2A）；對(duì)照組軟骨面較為光滑、平整，軟骨著色均勻，軟骨細(xì)胞數(shù)量多，基質(zhì)豐富，無(wú)局灶性增生（圖2B）。

圖2 股骨髁HE 染色結(jié)果（×20）

2.3 番紅O-固綠染色結(jié)果

觀察組軟骨表面存在裂隙，軟骨層著色強(qiáng)度不均勻，番紅染色在成簇狀軟骨細(xì)胞周?chē)钊荆p較重的軟骨表面有失染現(xiàn)象，軟骨基質(zhì)及細(xì)胞數(shù)減少，成簇狀排列，軟骨層與軟骨下骨未見(jiàn)明顯邊界，軟骨下方穿插有綠染的骨組織（圖3A）；對(duì)照組軟骨面平整，軟骨區(qū)域著色均勻，無(wú)深染或失染現(xiàn)象，細(xì)胞核數(shù)量較觀察組多，排列分散、紊亂，軟骨基質(zhì)豐富，于軟骨下骨可見(jiàn)明顯分界，軟骨無(wú)硬化或纖維化表現(xiàn)（圖3B）。

圖3 股骨髁番紅O-固綠染色結(jié)果（×20）

2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Osterix 蛋白在胞核中表達(dá)，呈棕褐色。觀察組軟骨細(xì)胞中的Osterix 陽(yáng)性表達(dá)少于對(duì)照組（圖4）。觀察組Osterix 蛋白OD 值低于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 Osterix 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（±s）

表1 Osterix 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（±s）

組別Osterix 蛋白OD 值觀察組1.156±0.588對(duì)照組4.035±1.076 t 值10.161 P 值＜0.001

圖4 股骨髁Osterix 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×20）

2.5 掃描電鏡結(jié)果

在10 000 倍掃描電子顯微鏡下可觀察到，觀察組軟骨毀損嚴(yán)重、結(jié)構(gòu)不清，軟骨面凹凸不平，存在大量增生凸起及空洞裂隙；對(duì)照組表面較為光潔，可見(jiàn)大量軟骨細(xì)胞凸起及皺褶，軟骨間質(zhì)均勻，見(jiàn)圖5。

圖5 掃描電子顯微鏡結(jié)果（×5 000）

3 討論

KOA 是老年人常見(jiàn)的退行性關(guān)節(jié)疾病。KOA的主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限，隨著年齡的增長(zhǎng)以及長(zhǎng)期的高運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)韌帶松弛、關(guān)節(jié)軟骨撞擊過(guò)度，從而使膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)退變。因此，這種退變最易侵犯和最主要的發(fā)病部位是關(guān)節(jié)軟骨，在KOA 終末期可致關(guān)節(jié)功能障礙甚至殘疾[8]。

嚴(yán)重KOA 患者除了出現(xiàn)疼痛和功能障礙外，更多表現(xiàn)為屈曲攣縮并內(nèi)翻畸形。由于膝關(guān)節(jié)在活動(dòng)中膝內(nèi)側(cè)間室承載的負(fù)荷最大，占人體重量的65%～70%[9]，膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間室高負(fù)荷的承載，使膝關(guān)節(jié)生物力線發(fā)生變化，出現(xiàn)不同程度的內(nèi)側(cè)副韌帶及半膜肌腱攣縮；外側(cè)副韌帶松弛、內(nèi)側(cè)半月板和脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)磨損、下沉等，從而使膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間室軟骨退變磨損、膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻加重[10]。

正常關(guān)節(jié)軟骨由4 層組成，依次為淺表層、過(guò)渡層、輻射層和鈣化層，前3 層合并稱(chēng)為透明軟骨[11]。軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞共同構(gòu)成了關(guān)節(jié)軟骨，軟骨基質(zhì)主要由水、膠原纖維和蛋白多糖構(gòu)成，蛋白多糖存在于膠原纖維之間，屬于親水分子，可產(chǎn)生高度張力，提供關(guān)節(jié)軟骨的彈性和韌性，而水占關(guān)節(jié)軟骨重量的80%，可保持軟骨組織的正常形態(tài)。關(guān)節(jié)的軟骨下骨由軟骨下骨板和骨小梁組成。膝關(guān)節(jié)軟骨尤其是股骨髁軟骨的退行性變及生物學(xué)特異性可能是KOA 重要的影響因素，關(guān)節(jié)軟骨退行性變與關(guān)節(jié)軟骨下骨塑形改建在KOA 內(nèi)翻畸形的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。關(guān)節(jié)軟骨鈣化層的病變協(xié)同軟骨下骨的塑形改建進(jìn)一步加快了關(guān)節(jié)軟骨退行性變的進(jìn)程，更有可能是KOA 內(nèi)翻畸形的始動(dòng)因素[12]。

本研究通過(guò)大體觀察、光鏡及掃描電鏡等對(duì)KOA 內(nèi)翻畸形股骨髁內(nèi)側(cè)髁與外側(cè)髁的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，大體觀察結(jié)果可以看到股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)面不光整，并有缺損，色澤灰暗、變黃，軟骨下骨外露，股骨髁邊緣骨贅多處可見(jiàn)，可能是隨著年齡的增長(zhǎng)及關(guān)節(jié)反復(fù)活動(dòng)出現(xiàn)關(guān)節(jié)磨損，大量關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解，導(dǎo)致KOA 內(nèi)翻畸形患者關(guān)節(jié)軟骨表面變薄、缺損及粗糙不平。且隨著OA 病變發(fā)展，關(guān)節(jié)軟骨深層出現(xiàn)裂隙并進(jìn)一步加深[13]。此外，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生色澤上由正常的乳白色半透明狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘迭S、渾濁的形態(tài)學(xué)改變。HE 染色結(jié)果顯示，KOA 內(nèi)翻畸形股骨髁內(nèi)側(cè)髁軟骨表面殘缺不齊，軟骨細(xì)胞排列紊亂，呈團(tuán)狀雜亂分布，軟骨陷窩及軟骨下骨可觀察到彌漫性局灶增生改變。提示軟骨細(xì)胞的代謝、更新是持續(xù)存在的，也說(shuō)明存在軟骨細(xì)胞再生及軟骨基質(zhì)中的水及蛋白含量異常改變。然而，此改變并不能阻止淺表層軟骨退變、缺損和凋亡等病理過(guò)程的發(fā)生發(fā)展[14-16]。通過(guò)番紅O-固綠染色，可以觀察到KOA 內(nèi)翻畸形股骨髁內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)含量明顯減少，嗜堿性番紅染色著色不一，嗜酸性固綠染色在關(guān)節(jié)軟骨層接近軟骨下骨的部分有著色，說(shuō)明軟骨下骨的基質(zhì)已發(fā)生纖維化改變，這也可能是軟骨下骨化的重要原因。推測(cè)在KOA 病變的前期，軟骨基質(zhì)的變化可能早于軟骨細(xì)胞[17]，此病理過(guò)程由細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、蛋白聚糖酶等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控[18-19]。

本研究還觀察到，對(duì)照組患者的KOA 內(nèi)翻畸形股骨髁內(nèi)側(cè)髁軟骨組織及軟骨下骨中都檢測(cè)到了大量的Osterix 陽(yáng)性表達(dá)，而觀察組的KOA 內(nèi)翻畸形股骨髁外側(cè)髁軟骨組織有少量表達(dá)。Osterix 蛋白是一種在骨基質(zhì)、骨膜和軟骨基質(zhì)高表達(dá)的極不穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子，其穩(wěn)定性可因多種因素改變，被視為衡量基質(zhì)蛋白穩(wěn)定性、成骨活性和轉(zhuǎn)錄潛能的標(biāo)志[18]。通過(guò)掃描電鏡觀察，KOA 內(nèi)翻畸形股骨髁內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨缺損嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)紊亂，有代償性增生及軟骨缺失后出現(xiàn)的空洞裂隙。從超微結(jié)構(gòu)上觀察到，KOA 發(fā)展到中、晚期出現(xiàn)嚴(yán)重的內(nèi)翻畸形，負(fù)重關(guān)節(jié)的股骨內(nèi)髁與脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨面互相磨損、缺失及塌陷等病理改變漸進(jìn)性加重[6]。

綜上所述，本研究通過(guò)組織形態(tài)學(xué)觀察KOA內(nèi)翻畸形兩側(cè)的股骨髁關(guān)節(jié)軟骨，通過(guò)其病理改變證實(shí)了關(guān)節(jié)軟骨鈣化層的病變協(xié)同軟骨下骨的塑形改建在KOA 內(nèi)翻畸形病情的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，這為進(jìn)一步探討KOA 在中、晚期病變中出現(xiàn)內(nèi)翻畸形的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究還存研究的臨床病例有限和缺少分子生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、相關(guān)指標(biāo)及具體的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)等不足，有待今后的臨床基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。