馬 星， 桂 娜， 馬 婷， 王秀玉， 莫廷潤(rùn)， 張鳴號(hào)

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004； 3.寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004； 4.寧夏賀蘭縣人民醫(yī)院，賀蘭 750200）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是引起動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖和遷移在Hcy 致As 發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[2]，但Hcy 致VSMC 增殖遷移的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚。微小RNA（microRNAs，miRNAs）可以通過影響miRNA 降解或翻譯，調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起著重要作用[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 參與調(diào)控As發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程[4]。在Hcy 致VSMC 增殖遷移過程中是否受miRNAs 的調(diào)控有待進(jìn)一步研究。本研究旨在探討Hcy 致VSMC 增殖遷移過程中miRNAs 的差異表達(dá)，并分析預(yù)測(cè)其下游靶基因，以期為明確Hcy 致VSMC 增殖遷移的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人源VSMC 株（蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司），Hcy（美國(guó)Sigma 公司），CCK-8 試劑盒（美國(guó)GlpBio 公司）。microRNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司），small RNA-seq 文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），NovaSeq 6000 S4 測(cè)序試劑盒（美國(guó)Illumina公司），總RNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMC，使用第3～7 代細(xì)胞。當(dāng)VSMC 的融合度達(dá)到80%后，將VSMC 分為Control 組和100 μmol·L-1Hcy 組[5-6]。100 μmol·L-1Hcy 刺激VSMC 48 h，采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VSMC 增殖；采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VSMC 遷移。

1.3 細(xì)胞增殖活力測(cè)定

VSMC 以100 μL/孔，1×103～1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板24 h，使其附著。然后用含100 μmol·L-1Hcy 的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。細(xì)胞孵育48 h。每孔中加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1 h。避光后取出96 孔板水平振蕩30 s。用酶標(biāo)儀在450 nm 處記錄，各孔光密度=［OD（加藥）-OD（空白）］/［OD（0 加藥）-OD（空白）］×100%。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

用馬克筆在6 孔板背后均勻地畫出橫線，作為標(biāo)記。將VSMC 懸液以100 μL/孔（約5×103個(gè)細(xì)胞）的體積接種于6 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%～95%融合后，用200 μL 的槍頭按照馬克筆畫出的橫線在細(xì)胞表面畫線，然后吸去培養(yǎng)基，分別加入含0、100 μmol·L-1Hcy 的培養(yǎng)基培養(yǎng)0 h和48 h。將6 孔板取出，在顯微鏡下觀察劃痕的面積并拍照取樣。采用Image J 軟件測(cè)量劃痕面積。

1.5 高通量測(cè)序

采用microRNA 快速提取試劑盒/TRIzol 試劑提取Control 組和Hcy 組VSMC 中的核酸，檢測(cè)核酸濃度和完整性，構(gòu)建small RNA-seq 文庫(kù)，通過Illumina NovaSeq 6000 平臺(tái)測(cè)序完成6個(gè)樣品的small RNA 測(cè)序（各樣品Q30≥85%），得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別（base calling）轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（raw data 或raw reads），結(jié)果以FASTQ 文件格式存儲(chǔ)，其中包含測(cè)序序列的序列信息及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。

1.6 生物信息學(xué)分析

1.6.1 miRNAs 鑒定 使用BMKCloud（https://www.biocloud.net/）、miRBase（v22）數(shù)據(jù)庫(kù)和miRDeep2軟件包鑒定已知miRNAs 和預(yù)測(cè)新miRNAs，并對(duì)miRNAs 表達(dá)進(jìn)行定量分析，篩選差異表達(dá)miRNAs。

1.6.2 miRNAs 的表達(dá)量分析 對(duì)各樣本中miRNAs 進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，并用TPM 算法[7]對(duì)表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。TPM 歸一化處理公式為：TPM={（Readcount*1 000 000）over Mapped Reads}。公式中，Readcount 表示比對(duì)到某一miRNA 的reads 數(shù)目；Mapped Reads 表示比對(duì)到所有miRNAs 上的reads 數(shù)目。

1.6.3 差異表達(dá)miRNAs 的篩選 使用EdgeR軟件[8]進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得兩個(gè)樣品之間的差異表達(dá)miRNAs。差異分組使用“A_vs_B”的方式命名。根據(jù)兩（組）樣品之間表達(dá)水平的相對(duì)高低，差異表達(dá)miRNAs 可以劃分為上調(diào)miRNAs（Up-regulated miRNA）和下調(diào)miRNAs（Downregulated miRNA），上調(diào)miRNA 在樣品（組）B 中的表達(dá)水平高于樣品（組）A 中的表達(dá)水平，反之為下調(diào)miRNAs。

1.6.4 miRNAs 靶基因預(yù)測(cè) 采用miRanda 和TargetScan 軟件進(jìn)行差異表達(dá)miRNAs 的下游靶基因預(yù)測(cè)，使用BLAST 軟件將預(yù)測(cè)靶基因序列與GO[9]和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)[10]，獲得可能的靶基因信息。

1.6.5 RT-qPCR 按照總RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行VSMC 中的總RNA 提取，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃15 min，37 ℃5 s，4 ℃保存。根據(jù)miRNA39、miRNA206 和miRNA212-5p 的基因序列，由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)引物，PCR 引物序列見表1。RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：37 ℃30 s、95 ℃5 min、95 ℃10 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，共45 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù)，對(duì)所得的Ct 值進(jìn)行分析，利用公式2-ΔΔCt計(jì)算得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt=（Ct 待測(cè)樣本目的基因-Ct 待測(cè)樣本內(nèi)參基因）-（Ct 校正樣本目的基因-Ct 校正樣本內(nèi)參基因）。

表1 PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Stu-dent-Newman-Keuls 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy 促進(jìn)VSMC 增殖

為了研究Hcy 對(duì)VSMC 增殖的影響，采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)100 μmol·L-1Hcy 對(duì)VSMC 增殖的影響。結(jié)果顯示，與Control 組比較，Hcy 組VSMC 的增殖能力增強(qiáng)（P＜0.01），見圖1。

圖1 Hcy 對(duì)VSMC 增殖的影響

2.2 Hcy 促進(jìn)VSMC 遷移

為了驗(yàn)證Hcy 對(duì)VSMC 遷移能力的影響，本研究使用了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察劃傷細(xì)胞0 h 和48 h 后的遷移能力變化。與Control 組比較，Hcy組VSMC 的劃痕面積在0 h 無變化，而在48 h時(shí)較Control 組減?。≒＜0.05），見圖2。

圖2 Hcy 促進(jìn)VSMC 遷移

2.3 miRNAs 分析

2.3.1 miRNA 表達(dá)量總體分布與鑒定 miRNAs表達(dá)量總體分布圖能反映樣品中miRNAs 的整體表達(dá)模式，Control 組和Hcy 組VSMC 中共得到576 個(gè)miRNAs，其中已知miRNAs 404 個(gè)，新預(yù)測(cè)miRNAs 172 個(gè)，見圖3、表2。

圖3 各組VSMC 中TPM 密度分布圖

表2 各組VSMC 中miRNAs 鑒定結(jié)果（個(gè)）

2.3.2 差異表達(dá)的miRNAs 與Control 組比較，Hcy 組存在88 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中表達(dá)上調(diào)的miRNAs 有20 個(gè)，表達(dá)下調(diào)的miRNAs 有68 個(gè)。通過miRNAs 功能分析，與增殖、遷移相關(guān)的miRNAs 共有20個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的miRNAs 包括miRNA39、miRNA206 和miRNA212-5p，表達(dá)下調(diào)的miRNAs 包括miRNA35 、miRNA25 、miRNA149、miRNA10、miRNA128、miRNA159、miRNA54、miRNA148、miRNA44 、miRNA106 、miRNA146 、miRNA6 、miRNA144、miRNA47、miRNA8、miRNA161 和miRNA90，見圖4、圖5。

圖5 與VSMC 增殖和遷移相關(guān)的miRNAs 的差異表達(dá)

2.4 miRNAs 靶基因的預(yù)測(cè)分析

采用miRanda 和TargetScan 軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，顯示576 個(gè)miRNAs 共存在9 966 個(gè)下游靶基因，見表3，使用BLAST 軟件將預(yù)測(cè)靶基因序列與GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，分析靶基因的功能，見圖6，獲得與VSMC 增殖和遷移相關(guān)的差異miRNAs 的靶基因信息，見表4。

圖6 各組VSMC 中差異表達(dá)miRNAs 靶基因的GO 分類統(tǒng)計(jì)圖和KEGG 分類圖

表4 與VSMC 增殖和遷移相關(guān)的差異miRNAs 的靶基因預(yù)測(cè)

2.5 Hcy 上調(diào)VSMC 中miRNA212-5p

為了驗(yàn)證差異表達(dá)miRNAs 預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用RT-qPCR 法檢測(cè)兩組細(xì)胞中miRNA39、miRNA206 和miRNA212-5p 的表達(dá)。結(jié)果顯示，Hcy 組miRNA212-5p 的表達(dá)上調(diào)（P ＜0.05），miRNA206 和miRNA39 的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。

圖7 Hcy 對(duì)VSMC 中miRNA39、miRNA206 和miRNA212-5p 的表達(dá)的影響

3 討論

As 是一個(gè)涉及復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和多種效應(yīng)分子的慢性炎癥過程[11]，As 的形成是致病因素和血管壁中的多種細(xì)胞，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、VSMC 等相互作用的結(jié)果[12]，具體表現(xiàn)為血管內(nèi)膜損傷、趨化因子和炎性因子激活、脂質(zhì)浸潤(rùn)，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，VSMC 增殖、遷移，巨噬細(xì)胞形成、遷移，泡沫細(xì)胞形成和粥樣斑塊形成等病理過程[13]。其中，VSMC 作為As斑塊增殖體系中的活躍細(xì)胞之一[2]，位于動(dòng)脈管壁的中層，是As 斑塊中巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的主要來源[14]。當(dāng)血管壁受到內(nèi)外環(huán)境因素刺激，或VSMC 受到炎性因子、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子、血管活性肽、藥物損傷、機(jī)械作用等病理因素刺激后，可引起VSMC 增殖和凋亡平衡失調(diào)，出現(xiàn)VSMC 增殖和遷移。VSMC 的增殖和遷移與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷被認(rèn)為是As 形成過程中的主要始動(dòng)環(huán)節(jié)[15-16]。VSMC 過度增殖并穿過基底膜向血管內(nèi)皮下遷移，通過吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞，最終發(fā)展為纖維斑塊[17]。目前雖然對(duì)于As已有較多研究，但對(duì)VSMC 增殖和遷移的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚。

Hcy 是一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸（蛋氨酸）代謝的中間產(chǎn)物。Hcy 誘發(fā)As 是經(jīng)多種通路相互作用、相互關(guān)聯(lián)的，血漿Hcy 每增加5 μmol·L-1，相當(dāng)于膽固醇升高0.5 mmol·L-1，而血管危險(xiǎn)性約增加1/3[1]。Hcy 可以通過影響內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC 功能，參與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，以及PI3K、p53、PTEN、MFN2、PDG 等改變基因表達(dá)活性等多種機(jī)制，促進(jìn)As 的發(fā)生發(fā)展[6]。在本研究中，100 μmol·L-1Hcy 干預(yù)促進(jìn)了VSMC 的增殖和遷移，這與既往的研究結(jié)果一致[2，6，17]。然而Hcy 引起VSMC 增殖和遷移的機(jī)制尚不十分明確。

miRNAs 為內(nèi)源性非編碼的短鏈RNA，是一種高效且特異的基因表達(dá)調(diào)控因子，通過與特定靶基因（miRNA）的3’UTR（非翻譯區(qū)）結(jié)合致miRNA 降解或翻譯抑制，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，調(diào)節(jié)靶蛋白參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等基本生物過程，在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起重要作用[18]。目前正在進(jìn)行臨床前開發(fā)的miRNAs 模擬物和miRNAs 抑制劑已顯示出作為新型治療藥物的前景。多種技術(shù)平臺(tái)已被開發(fā)用于miRNAs 分離、miRNAs 定量、miRNAs 譜分析、miRNAs 靶點(diǎn)檢測(cè)和調(diào)節(jié)體內(nèi)外miRNAs 水平[19]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，miRNAs 參與調(diào)控As 形成、發(fā)展的病理生理過程，參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的生物學(xué)功能。但是在Hcy 誘導(dǎo)VSMC 增殖和遷移的過程中，Hcy 是否通過差異表達(dá)的miRNAs 影響VSMC 的增殖和遷移，尚需要進(jìn)一步研究。

本研究在Hcy 誘導(dǎo)VSMC 增殖和遷移的基礎(chǔ)上，通過高通量測(cè)序分析各組VSMC 中差異化表達(dá)的miRNAs，并對(duì)差異表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行功能分析和靶基因預(yù)測(cè)。但Hcy 是否通過上述差異表達(dá)的miRNAs 及其下游靶基因發(fā)揮誘導(dǎo)VSMC 增殖和遷移的作用，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。