陸劍華,陳其釗,王桂華,高裕鋒,陳嘉敏,韓秋珍,黃可靜,李穎茵

(廣東省科學院生物與醫(yī)學工程研究所(國家糖業(yè)質量檢驗檢測中心),廣州 510316)

綠原酸(CGA)是由咖啡酸與奎寧酸縮合成的酯,是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物[1-2]。根據(jù)酯化位置和數(shù)目的不同,可將綠原酸及其類似物分為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C等7種[2]。

綠原酸具有抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗痙攣、降血糖、保護肝臟和神經(jīng)等作用,是許多中成藥的重要功效成分[3-4]。綠原酸的萃取工藝主要有水提醇沉法、加熱回流法、超聲法、酶法等,這些方法均存在萃取時間長、溶劑消耗大等缺點[5-9]。其他方法如超臨界流體萃取法設備昂貴;微波輔助萃取技術具有耗時短、試劑耗費少,選擇性、萃取率高,后處理方便,安全和環(huán)境友好等優(yōu)點,且萃取過程中藥粉不凝聚、不糊化[10],應用十分廣泛[11-16],但在萃取中成藥綠原酸中應用的報道較少。本工作通過單因素法和響應面法優(yōu)化微波輔助萃取條件,并在優(yōu)化的條件下萃取涼茶顆粒樣品中綠原酸、新綠原酸、 隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等7種綠原酸及其類似物,以高效液相色譜法(HPLC)同時測定,取得了滿意結果。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290型高效液相色譜儀;MDS-15型密閉式高通量微波消解/萃取工作站;KQ-500DE型超聲波清洗機;VORTEX 3型渦旋混合器;CL5R型醫(yī)用離心機;Milli-Q 型超純水系統(tǒng)。

單標準儲備溶液:1 000 mg·L-1,分別取適量綠原酸、新綠原酸、 隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C標準品,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,搖勻備用。

混合標準溶液系列:取適量單標準儲備溶液,渦旋均勻后,用甲醇稀釋,配制成各目標物質量濃度為0.01,0.05,0.1,0.5,1.0,2.0, 4.0 mg·L-1的混合標準溶液系列。

綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等標準品的純度均不小于98%;甲醇、乙腈均為色譜純;甲酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸均為分析純;試驗樣品均采購于藥店,樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;二極管陣列檢測器;進樣量10 μL;檢測波長325 nm;流動相A為0.1%(體積分數(shù),下同)磷酸溶液,B為甲醇;流量1.0 mL·min-1。梯度洗脫程序:0～2.00 min,A由90%降至85%;2.00～10.00 min,A由85%降至75%;10.00～20.00 min,A 由75%降至67%;20.00～27.00 min,A由 67%降至58%,保持13.00 min;40.00～40.01 min,A 由58%跳轉至90%,保持4.99 min。

1.3 試驗方法

取1.00 g涼茶顆粒樣品,加入20 mL 70%(體積分數(shù),下同)甲醇溶液,渦旋溶解1 min,置于微波萃取儀中,于80 ℃萃取 2.0 min。結束后搖勻,以0.22 μm濾膜過濾,濾液按照色譜條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相

參照相關文獻[17-27],考察了分別以0.5%(體積分數(shù),下同)磷酸溶液-甲醇、0.1%磷酸溶液-甲醇、0.1%(體積分數(shù),下同)乙酸溶液-甲醇、0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液-甲醇、0.1%(體積分數(shù),下同)三氟乙酸溶液-甲醇、0.1%三氟乙酸溶液-乙腈和0.1%三氟乙酸溶液-甲醇-乙腈這些體系作流動相時對7種目標物分離效果的影響。結果顯示:以0.1%甲酸溶液作水相時,異綠原酸A和異綠原酸B色譜峰重疊;以0.1%乙酸溶液作水相時,7種目標物的色譜峰均拖尾;以甲醇作有機相時,7種目標物色譜峰沒有重疊現(xiàn)象;乙腈洗脫能力比較強,作有機相時,異綠原酸A和洋薊素色譜峰容易重疊;用0.1%磷酸溶液-甲醇、0.1%三氟乙酸溶液-甲醇體系進行洗脫時,洗脫效果均較好,且峰形對稱。磷酸是實驗室更常用的試劑,因此試驗選擇0.1%磷酸溶液-甲醇體系作流動相。進一步考察了磷酸體積分數(shù)分別為0.1%, 0.2%, 0.5%, 1.0%時對7種目標物分離效果的影響。結果顯示,隨著磷酸體積分數(shù)的增加,7種目標物的保留時間整體延長,但是其分離度、峰形以及響應值均變化不大。從保護色譜柱的角度出發(fā),試驗選擇的流動相為0.1%磷酸溶液-甲醇體系。

2.1.2 色譜柱

試驗比較了分別以ECOSILC18-eco 100A C18、Diamonsil Plus C18、Shim-pack VP-ODS C18、GL-InertSustain C18、ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱作固定相時7種目標物的分離效果,結果見圖1。

圖1 不同色譜柱分離情況考察Fig.1 Investigation of separation conditions on different chromatographic columns

由圖1可知:以Diamonsil Plus C18色譜柱分離時,異綠原酸A和洋薊素色譜峰出現(xiàn)重疊;以Shim-pack VP-ODS C18色譜柱分離時,異綠原酸A和洋薊素色譜峰較寬,也出現(xiàn)重疊;以GL-InertSustain C18色譜柱分離時,異綠原酸B、異綠原酸A、洋薊素和異綠原酸C的色譜峰形較差;以ZORBAX Eclipse Plus C18和ECOSIL C18-eco 100A C18色譜柱分離時,7種目標物能達到基線分離,且峰形對稱。綜合考慮,試驗選擇采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱分離7種目標物。

2.1.3 柱溫

柱溫對7種目標物的分離效果影響較大[24],因此試驗考察了柱溫分別為25, 30, 35, 40 ℃時對7種目標物分離效果的影響。結果顯示:柱溫升高,7種目標物的保留時間整體縮短,分離度變化不大。從節(jié)省試驗時間角度考慮,試驗選擇的柱溫為30 ℃。

2.1.4 檢測波長

用二極管陣列檢測器進行全波長掃描,測得綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的最大吸光度對應波長均為325 nm,因此試驗選擇的檢測波長為325 nm。

2.2 萃取方法的選擇

分別采用微波輔助萃取法和超聲萃取法萃取樣品中的目標物。其中:進行超聲萃取時,先準確取1.00 g涼茶顆粒樣品,加入適量甲醇,渦旋溶解1 min,超聲萃取30 min,用甲醇定容到25 mL,搖勻,過0.22 μm濾膜,濾液按照色譜條件測定。在10個實際樣品中,羅浮山黑娃涼茶和金銀花固體飲料中均未檢出各目標物,其他樣品中目標物的檢出情況見表2。

表2 實際樣品中7種目標物的測定值

由表2可知,微波輔助萃取法及超聲萃取法測得的涼茶顆粒中7種目標物種類一致,微波輔助萃取法所得各目標物的含量整體高于超聲萃取法的,說明微波輔助萃取法在涼茶顆粒的多指標成分質量評價中應用較優(yōu)。因此,試驗選擇的萃取方法為微波輔助萃取法。

2.3 單因素試驗

2.3.1 萃取溶劑的選擇

試驗考察了萃取溶劑甲醇溶液的體積分數(shù)分別為10%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%時對夏桑菊顆粒樣品中7種目標物總峰面積的影響,結果見圖2。

圖2 甲醇溶液體積分數(shù)對7種目標物總峰面積的影響Fig.2 Effect of volume fraction of methanol solution onthe total peak area of 7 targets

由圖2可知:當甲醇溶液體積分數(shù)從10%增至70%時,7種目標物的總峰面積逐漸增大,甲醇溶液體積分數(shù)為70%時總峰面積較大;甲醇溶液體積分數(shù)繼續(xù)增加,7種目標物的總峰面積減小。綜合考慮,試驗選擇甲醇溶液體積分數(shù) 50%, 70%, 90%進行響應面法試驗。

2.3.2 萃取時間的選擇

試驗考察了萃取時間分別為1, 2, 3, 4, 5 min時對夏桑菊顆粒樣品中7種目標物總峰面積的影響,結果見圖3。

圖3 萃取時間對7種目標物總峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction time on the total peak area of 7 targets

由圖3可知:萃取時間從1 min延長至2 min時,7種目標物總峰面積明顯增大,2 min時總峰面積最大;萃取時間繼續(xù)延長,總峰面積基本保持不變。綜合考慮節(jié)約能源及萃取效率等因素,試驗選擇 1, 2, 3 min進行響應面法試驗。

2.3.3 萃取溫度的選擇

試驗考察了萃取溫度分別為40, 50, 60, 70, 80 ℃時對夏桑菊顆粒樣品中7種目標物總峰面積的影響,結果見圖4。

圖4 萃取溫度對7種目標物總峰面積的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the total peak area of 7 targets

由圖4可知:隨著萃取溫度的升高,7種目標物的總峰面積呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢;當萃取溫度為70 ℃時總峰面積最大。推測:隨著萃取溫度的升高,分子熱運動增強,樣品與萃取溶劑的接觸概率增加,但是過高的萃取溫度會促進目標物氧化,導致總峰面積減小。綜合考慮萃取效率等因素,試驗選擇萃取溫度 60,70,80 ℃進行響應面法試驗。

2.3.4 料液比的選擇

試驗考察了料液比[樣品用量(g)…萃取溶劑體積(mL)]分別為1…5, 1…10, 1…15, 1…20, 1…30時對夏桑菊顆粒樣品中7種目標物總峰面積的影響,結果見圖5。

圖5 料液比對7種目標物總峰面積的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the total peak area of 7 targets

由圖5可知:當料液比為1…5～1…30時,7種目標物的總峰面積隨著料液比的減小而增大,當液料比為1…20時總峰面積較大。因此,試驗選擇 1…10, 1…20, 1…30進行響應面試驗。

2.4 響應面試驗

2.4.1 回歸模型的建立與顯著性檢驗

采用Box-Behnken中心組合設計,以7種目標物的總含量為響應值,2.3節(jié)優(yōu)化所得的結果進行四因素三水平試驗,響應面試驗因素與水平見表3。其中:四因素分別為萃取溶劑甲醇溶液體積分數(shù)(A)、萃取時間(B)、萃取溫度(C)、料液比(D),共進行29組試驗;對中心點“0”水平重復試驗5次,以計算回歸模型誤差。

表3 響應面試驗因素與水平

Box-Behnken試驗設計及結果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果

使用Design-Expert 13.0軟件對表4數(shù)據(jù)進行擬合,所得回歸模型為二次多項回歸方程[公式(1)]。

Y=42.54-1.49A+0.433 1B+1.160C+

0.413 0D-3.210AB+2.070AC-

5.280AD+0.692 5BC-2.860BD-

2.100CD-7.680A2-5.690B2-

2.460C2-3.680D2

(1)

所得回歸模型的顯著性檢驗及方差分析結果見表5。其中:“*”表示P<0.05,差異顯著;“**”表示P<0.01,差異極顯著。

表5 回歸模型的顯著性檢驗及方差分析結果

由表5可知:所建回歸模型的P值為0.0148,小于0.05,表明所建回歸模型對所有變量的分析具有顯著意義,響應面試驗設計可靠;回歸模型的失擬項P值為0.383 9,大于0.05,說明該回歸模型擬合較好;A2,B2對7種目標物總含量的影響極顯著,AD,D2的影響顯著;以F值評價各因素對涼茶顆粒中7種目標物總含量的影響,影響由大到小分別為A,C,B,D,交互因素由大到小分別為AD,AB,BD,AC,CD,BC。

2.4.2 各因素交互作用的響應面分析

以響應面和等高線(響應曲面的投影)形狀來判斷兩因素的交互程度[28],結果見圖6。

圖6 因素交互作用對7種目標物總含量影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagrams of the effect of factor interaction on total content of 7 targets

由圖6可知:各因素的交互作用的等高線中,AD、AB的等高線偏橢圓形,AD的更顯著;AD的響應面較其他響應曲更陡峭,AB次之。以上結果說明,AD、AB的交互作用較強,這與方差分析結果一致。

2.4.3 最優(yōu)萃取條件的預測和試驗驗證

采用 Design-Expert 13軟件優(yōu)化回歸模型,所得最優(yōu)萃取條件為甲醇溶液體積分數(shù)71.06%, 萃取時間1.874 min, 萃取溫度79.672 ℃, 料液比 1…16.443,該條件下7種目標物的總測定值為41.10 mg·kg-1。綜合考慮實際情況和可操作性,將7種目標物的最優(yōu)萃取條件設定為甲醇溶液體積分數(shù)70%, 萃取時間2.0 min, 萃取溫度80 ℃,料液比 1…20,在該條件下進行5次平行試驗,得到7種目標物的總測定值為32.98 mg·kg-1,是預測值的80.3%,進一步證明了該模型有一定的可靠性。

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以7種目標物的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,7種目標物的質量濃度均在0.01～4.0 mg·L-1內和峰面積呈線性關系,其他線性參數(shù)見表6。

表6 線性參數(shù)、檢出限和測定下限

分別以3, 10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果見表6。

2.5.2 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品(谷芽配方顆粒)進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平進行6次平行測定,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表7。

表7 精密度和回收試驗結果 (n=6)

由表7可知,7種目標物的回收率為97.5%～105%,測定值的RSD為1.4%～6.9%,說明本方法具有較好的準確度和精密度。

本工作以涼茶顆粒為研究對象,以微波輔助萃取-HPLC測定涼茶顆粒中7種綠原酸及其類似物的含量,方法快速、可靠、準確、簡便,且溶劑用量少,可為中成藥中綠原酸質量監(jiān)控提供參考方法。