呂 妮,李 穎,李 蔚,胡清霞,陳雪梅,張琰杰,馬永華,王玉龍,王興龍*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.銅川市王益區(qū)疫病預(yù)防控制中心,陜西銅川 727000;3.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西漢中 723000)

林麝(Moschusberezovskii)又名香獐,其雄麝香腺囊分泌的麝香是中醫(yī)藥的名貴藥材,亦是一種高級香料,具有極高的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值[1]。林麝主要棲息于針闊混交林中,也適于在針葉林的環(huán)境生活,棲息高度可達(dá)2 000～3 800 m,但低海拔環(huán)境也能生存,在我國主要分布于北抵寧夏六盤山、陜西秦嶺山脈,東至安徽大別山、湖南西部,西至四川、西藏波密、察隅、云南北部,南至貴州、廣東及廣西北部山區(qū)[2]。為有效保護(hù)林麝,國家近年來支持鼓勵人工養(yǎng)殖林麝,但由于各養(yǎng)殖單位缺乏技術(shù)與種源交流,缺少龍頭企業(yè)和相關(guān)科研機(jī)構(gòu)示范引導(dǎo)和技術(shù)研究等,人工養(yǎng)殖林麝死亡率居高不下[3]。林麝的易發(fā)疾病有10類53種[4],呼吸道類疾病最多。本文收集死亡時間不超過24 h的林麝進(jìn)行剖檢,采集死亡林麝的淋巴結(jié)、肺臟、肝臟等病變組織,通過細(xì)菌分離鑒定、生化試驗和藥物敏感性試驗對分離菌進(jìn)行了特征分析,并為該病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和樣品來源 昆明小鼠15只,體重30～40 g,20日齡左右,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院。陜西省某林麝養(yǎng)殖基地死亡24 h內(nèi)的1只3歲左右的林麝,無菌采取其淋巴結(jié)、肺臟、肝臟等病變組織,低溫保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、DNA Marker DL 2 000 Plus、2×Taq MasterMix均為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌微量生化鑒定管,杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌DNA提取試劑盒(離心柱型),天根生化科技有限公司產(chǎn)品;恒溫?fù)u床(THZ-300)和恒溫培養(yǎng)箱(DRP-9162),上海森信有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 觀察臨床癥狀及剖檢 觀察記錄該基地發(fā)病林麝的臨床癥狀,對發(fā)病死亡的林麝進(jìn)行解剖,檢查內(nèi)臟病變,采集病料并進(jìn)行記錄。

1.2.2 細(xì)菌分離鑒定 無菌采取淋巴結(jié)、肺臟及肝臟病變組織的切面,分別涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基和5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng)24～36 h,觀察有無細(xì)菌生長。若有細(xì)菌生長,則用無菌接種環(huán)挑取形態(tài)一致的菌,采用三段劃線法分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基,置于37℃恒溫箱中純化培養(yǎng)12～16 h。優(yōu)勢菌進(jìn)行細(xì)菌純化后,對細(xì)菌進(jìn)行菌落形態(tài)的觀察和革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 生化試驗 將分離純化菌接種在葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甲基紅、過氧化氫酶、乙酰甲基甲醇、尿素、甘露醇、木糖、吲哚、乳糖和硫化氫等12種微量生化鑒定管,37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h,記錄結(jié)果并參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第8版進(jìn)行判斷。

1.2.4 16S rRNA基因測序及遺傳進(jìn)化分析 以分離菌株的DNA為模板,16S rRNA PCR通用引物L(fēng)PW-57(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和LPW-58(TACGGTTACCTTGTTACGACTT)為上下引物,20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增程序:94℃ 2 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35個循環(huán);72℃ 5 min。用PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳,比對目的條帶大小后將PCR產(chǎn)物送到西安擎科生物有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行Blast比對,并選取數(shù)據(jù)庫中部分菌株序列與分離菌株基因序列進(jìn)行系統(tǒng)遺傳進(jìn)化分析,用MEGA7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.5 藥敏試驗 分離菌的藥敏試驗用紙片法進(jìn)行。用生理鹽水將菌液矯正至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛?均勻涂布于普通營養(yǎng)瓊脂平板上,用無菌鑷子貼上藥敏片,置37℃恒溫箱培養(yǎng)18 h后,測量抑菌圈的直徑,抑菌環(huán)直徑判定依據(jù)歐盟藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)(EUCAST)。

1.2.6 小鼠致病性試驗 挑取純培養(yǎng)的單菌落溶于無菌PBS中制成菌懸液。將20日齡健康小鼠隨機(jī)分成3組,每組5只:陰性對照組、1×108CFU/mL劑量組和1×109CFU/mL劑量組。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水,0.25 mL/只;試驗組小鼠分別腹腔注射108和109CFU/mL的菌液,0.25 mL/只;觀察小鼠發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及病理變化

林麝發(fā)病初期體溫升高,部分體溫可達(dá)41℃,隨后出現(xiàn)精神沉郁、食欲廢絕、呼吸急促等癥狀;個別林麝出現(xiàn)跛行、頭頸扭曲等神經(jīng)癥狀。剖檢可見死亡林麝淋巴結(jié)、咽部以及膽囊腫大;肝臟邊緣鈍厚有出血點,且與胸腔產(chǎn)生粘連;肺臟腫大,廣泛性出血(圖1)。

圖1 樣品臨床癥狀及肺臟病變

2.2 細(xì)菌分離鑒定

將分離的優(yōu)勢菌在37℃恒溫箱培養(yǎng)12～16 h后,該菌在普通營養(yǎng)瓊脂上形成白色、圓形、凸起、直徑約1～3 mm、呈白蠟狀的菌落;在血瓊脂平板上形成淺灰色、圓形、凸起、似毛玻璃狀的菌落。革蘭氏染色鏡檢,該菌為革蘭氏陽性桿菌,呈單個或長鏈狀排列(圖2)。

A.普通營養(yǎng)瓊脂平板生長形態(tài);B.血平板生長形態(tài);C.革蘭染色鏡檢(1 000×)

2.3 生化試驗

生化鑒定結(jié)果顯示,該菌可分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甲基紅、過氧化氫酶、乙酰甲基甲醇等,但是不分解尿素、甘露醇、木糖、吲哚、乳糖、硫化氫等(表1)。與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第8版比對,該分離菌株為疑似蠟樣芽孢桿菌。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.4 16S rRNA基因測序結(jié)果及系統(tǒng)進(jìn)化樹

對分離菌株進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 300 bp(圖3),與預(yù)期片段大小一致。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行Blast比對分析,該菌與模式菌株Bacilluscereus同源性為99%,結(jié)合菌株的生化特性和形態(tài),鑒定該菌為蠟樣芽孢桿菌,命名為LN-20221212。通過Mega 7.0軟件對該菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4),該菌株和與其他分離菌株的同源性較遠(yuǎn)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.分離菌株; 2.鴨源蠟樣芽孢桿菌; 3.牛源蠟樣芽孢桿菌; 4.陰性對照

圖4 基于16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 藥敏試驗

蠟樣芽孢桿菌對哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢他啶、丁胺卡那、慶大霉素和環(huán)丙沙星敏感,對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、多黏菌素B和復(fù)方新諾明耐藥(表2)。

表2 分離菌的藥物敏感性試驗結(jié)果

2.6 小鼠致病性試驗

注射109CFU/mL的試驗小鼠4 h后出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振的癥狀,12 h后試驗組小鼠開始出現(xiàn)昏迷死亡現(xiàn)象,24 h內(nèi)攻毒小鼠全部死亡;注射108CFU/mL的試驗小鼠6 h后出現(xiàn)精神沉郁和食欲不振的癥狀,12 h后部分小鼠出現(xiàn)昏迷死亡現(xiàn)象,48 h后攻毒小鼠全部死亡。解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)肺臟腫大并出血;肝臟質(zhì)地變脆、顏色變灰,對照組小鼠無明顯異常。試驗組死亡小鼠肺臟、肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng),革蘭氏染色后鏡檢,得到典型的革蘭氏陽性芽孢桿菌,而對照組小鼠肺臟、肝臟細(xì)菌分離培養(yǎng),染色檢查未見該菌,表明了蠟樣芽孢桿菌對小鼠具有較強(qiáng)的致病性。

3 討論

蠟樣芽孢桿菌可引起人食物中毒和嚴(yán)重的非腸道感染[5]。該菌兩端平整,呈短鏈排列,無莢膜,有的菌株具有周鞭毛,屬于兼性厭氧菌,最適生長溫度為30～32℃,可生長pH為4.9～9.3,營養(yǎng)要求比較低。蠟樣芽孢桿菌的致病性與組織破壞性/反應(yīng)性胞外酶的產(chǎn)生密切相關(guān)[6]。在這些分泌性毒素中,有四種溶血素[7],3種不同的磷脂酶,1種嘔吐誘導(dǎo)毒素,以及3種成孔腸毒素,即溶血素BL(HBL)、非溶血性腸毒素(NHE)和細(xì)胞毒素K[8]。近年來,蠟樣芽孢桿菌感染動物的情況逐漸增多[9],許多地方報道了與蠟樣芽孢桿菌密切相關(guān)的仔豬腹瀉、奶牛子宮內(nèi)膜炎、馬皮膚膿腫結(jié)節(jié)、哺乳仔豬死亡、牛猝死等病例,分離的蠟樣芽孢桿菌對小鼠有不同程度的致死性[10]。

本文所用蠟樣芽孢桿菌來源于陜西省某林麝養(yǎng)殖場猝死林麝的淋巴結(jié)、肝臟和肺臟等病理組織。該菌對青霉素、苯唑西林、氨芐西林等獸醫(yī)臨床常用抗生素表現(xiàn)出較高的耐藥性,而慶大霉素、四環(huán)素與氟苯尼考等對該菌抑制作用明顯。分離菌株對健康小鼠有明顯的致病性,試驗組小鼠在接種菌液后出現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、顫抖甚至死亡。無菌分離采集死亡小鼠的病變組織,涂片染色后鏡檢,得到典型的革蘭氏陽性芽孢桿菌。試驗結(jié)果表明該菌具有致病性,為林麝相關(guān)疾病的治療和防控提供了參考。