呂昌洋,范汝鵬,趙茜曼,高憶凡,蔣猛林,李林玨,鄭丕苗,劉建柱,趙曉娜

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東泰安 271018)

重金屬鉻(Cr)毒性大,在生物體具有富集強(qiáng)的特點(diǎn)。進(jìn)入動(dòng)物體后,通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)全身,從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同的損害作用。畜禽吸收后將會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷消化道,造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟等器官的損傷[1]。研究發(fā)現(xiàn)六價(jià)鉻[Cr(Ⅵ)]通過(guò)人類腫瘤細(xì)胞系以及大鼠肝臟和垂體細(xì)胞中的線粒體途徑刺激細(xì)胞死亡[2]。

《醫(yī)學(xué)啟源》記載:“白術(shù)除濕益燥,和中益氣,溫中,去脾胃中濕,除胃熱,強(qiáng)脾胃,進(jìn)飲食,安胎”,具有健脾益氣,燥濕利水,止汗,安胎等功效。白術(shù)含有揮發(fā)油、多糖、黃酮類、氨基酸等活性成分,白術(shù)多糖是其主要活性成分之一,具有抗氧化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)及保肝等作用,但其在Cr(Ⅵ)毒性中的保護(hù)作用及其機(jī)制報(bào)道較少。因此,通過(guò)探究RAMPSt對(duì)Cr(Ⅵ)致PK-15細(xì)胞氧化損傷和染Cr(Ⅵ)小鼠腎損傷的保護(hù)作用,為中藥多糖緩解Cr(Ⅵ)所致腎損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、動(dòng)物及白術(shù)多糖 豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)由本實(shí)驗(yàn)室保存;40只Balb/c小鼠購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司;RAMPSt為本實(shí)驗(yàn)室提取保存,多糖含量為82%。

1.1.2 主要試劑 牛血清蛋白(BSA)和水溶性復(fù)合物(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒,北京康維世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品;蛋白裂解液、二甲基亞砜(DMSO)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和Tris Base,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;1.5 mol/L Tris (pH8.8)和1.5 mol/L Tris (pH6.8),湖北賽維爾公司產(chǎn)品;PVDF膜,Millpore公司產(chǎn)品;封閉專用脫脂奶粉(D8340)、細(xì)胞膜蛋白及細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、SOD、GSH和MDA檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)檢測(cè)試劑盒,上海碧云天技術(shù)有限公司產(chǎn)品;雅酶彩虹預(yù)染蛋白Marker,上海雅酶生物科技有限公司產(chǎn)品;Bcl-2抗體,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Bax抗體,Gene Tax公司產(chǎn)品;小鼠活性氧簇(ROS)ELISA檢測(cè)試劑盒,上海源桔生物科技有限公司產(chǎn)品;超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、小鼠抗GAPDH單克隆抗體Cat:60004,Proteintech公司產(chǎn)品;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,Dojindo公司產(chǎn)品;CCK-8試劑盒,Med Chem Express公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基,Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清,浙江四季青生物科技有限公司產(chǎn)品;胰蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品;二氧化碳培養(yǎng)箱,北京眾力挽生物科技有限公司產(chǎn)品;倒置生物顯微鏡,上海帝綸;流式細(xì)胞儀,Becton Dickinson公司產(chǎn)品;電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于含有50 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度箱中培養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物試驗(yàn) 40只6周齡小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Cr(Ⅵ)處理組(40 μmol/kg)、200 mg/kg RAMPSt組和200 mg/kg RAMPSt+Cr(Ⅵ)組,每組10只。采用灌胃方式連續(xù)給藥5 d,每天1次,治療組給藥RAMPSt按照小鼠體重計(jì)算(200 mg/kg),對(duì)照組以及Cr(Ⅵ)處理組灌胃等量的生理鹽水。于第6天剖檢并采集腎臟,并放-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞活力。將PK-15細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)。根據(jù)試驗(yàn)進(jìn)行分組,分別添加不同濃度的Cr(Ⅵ)(20、40、60、80、100 μmol)并處理不同的時(shí)間(6、12、24 h),以及40 μmol Cr(Ⅵ)和不同濃度的RAMPSt(50、100、200 、400 μg/mL)共處理,每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。加入CCK-8檢測(cè)液,并用酶標(biāo)儀在450 nm的波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度,評(píng)估細(xì)胞活力。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按照1.2.4方法進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)及分組,參照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書分析各組細(xì)胞凋亡,即采用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次,加入適量的緩存液進(jìn)行重懸,加入10 μL Annexin V-FITC混勻后,4℃孵育15 min再加入10 μL PI溶液混勻,并采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞 將PK-15細(xì)胞接種于6孔板,置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中并進(jìn)行分組。按照操作進(jìn)行爬片、洗滌、通透、封閉、孵育一抗并4℃過(guò)夜、孵育二抗1 h后并在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 將PK-15接種于6孔板并置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中。使用ROS檢測(cè)試劑盒,利用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平。即1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,最終濃度為10 μmol/mL,37℃培養(yǎng)孵育20 min。用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗3次,以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。收集細(xì)胞,并用1 mL的PBS重懸細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 MDA和GSH含量與SOD活力的檢測(cè) 將PK-15細(xì)胞置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%,采用胰酶法消化細(xì)胞后,按照試劑盒說(shuō)明書的方法測(cè)定MDA含量、GSH含量與SOD活力。

1.2.9 ELISA檢測(cè)ROS含量 將小鼠的腎臟組織在4℃冰浴下用生理鹽水制成10%組織勻漿,并取勻漿組織,參照試劑盒說(shuō)明書的方法檢測(cè)ROS的含量。

1.2.10 蛋白免疫印跡試驗(yàn) 將PK-15細(xì)胞置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,用細(xì)胞裂解液于冰上裂解各組細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白,BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白樣品濃度。并對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行蛋白變性,進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳,并轉(zhuǎn)至偏二氟乙烯(PVDF)膜上,然后在5%脫脂奶粉下封閉2 h。并用TBST洗滌,每次10 min,然后放入一抗Bcl-2、Bax、Caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)中,4℃過(guò)夜孵育;TBST充分洗滌PVDF膜3次,然后放入二抗中,室溫孵育60 min,TBST洗膜。然后通過(guò)顯影儀顯像得到的圖片用Image J 軟件對(duì)蛋白灰度值。

玉米粗縮病也稱玉米條紋矮縮病，是由灰飛虱吸食葉片汁液后，使玉米植株中毒感染病。染病癥狀是：植株扭曲生長(zhǎng)，有的植株發(fā)生矮化、節(jié)間縮短，呈叢生型（君子蘭苗），葉色渾綠，葉片厚短而寬，硬而脆，密集叢生。背面葉脈上產(chǎn)生粗細(xì)不一的蠟白條紋突起，用手摸有明顯的粗糙感，植株矮化嚴(yán)重，一般是在四至五葉片染病，一般不能抽穗，造成絕產(chǎn)，七葉片之后感病的植株能抽穗結(jié)實(shí)，但發(fā)育不良，減產(chǎn)幅度很大，因此玉米粗縮病是玉米生產(chǎn)上的指名病害。

2 結(jié)果

2.1 Cr(Ⅵ)的細(xì)胞毒性作用

PK-15細(xì)胞的活性隨著Cr(Ⅵ)的濃度和作用時(shí)間的增加而降低(圖1)。用Cr(Ⅵ)處理PK-15細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞損傷,呈時(shí)間和濃度梯度依賴性關(guān)系;在40 μmol Cr(Ⅵ)處理PK-15細(xì)胞12 h后,細(xì)胞的相對(duì)存活率為51.6%,因此選擇40 μmol Cr(Ⅵ)處理12 h作為后續(xù)的試驗(yàn)條件。

*P<0.05,**P<0.01。

2.2 RAMPSt對(duì)PK-15細(xì)胞活性的影響

在50～400 μg/mL時(shí),RAMPSt對(duì)PK-15細(xì)胞沒有損傷作用(圖2)。與對(duì)照組相比,40 μmol Cr(Ⅵ)處理組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01),200 μg/mL RAMPSt組細(xì)胞存活率較Cr(Ⅵ)處理組顯著增高(P<0.01)。因此,選用200 μg/mL RAMPSt作為后續(xù)試驗(yàn)濃度。

**P<0.01,NS P>0.05

2.3 RAMPSt對(duì)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組相比,Cr(Ⅵ)處理組PK-15細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.01),RAMPSt組較Cr(Ⅵ)處理組相比,細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.01)(圖3A和3B)。與對(duì)照組相比,Cr(Ⅵ)處理組細(xì)胞內(nèi)的MDA水平顯著升高(P<0.01),GSH、SOD水平顯著降低(P<0.01),而RAMPSt組較Cr(Ⅵ)處理組相比,細(xì)胞內(nèi)的MDA水平顯著降低(P<0.01),GSH、SOD水平顯著升高(P<0.01)(圖3C、圖3D和圖3E)。

A.ROS流式結(jié)果圖;B.ROS定量分析;C.細(xì)胞內(nèi)MDA含量;D.細(xì)胞內(nèi)SOD含量;E.細(xì)胞內(nèi)GSH含量。*P<0.05,**P<0.01,NS P>0.05

A.MMP結(jié)果圖;B.MMP變化的定量分析,**P<0.01,NS P>0.05

A.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Bcl-2;B.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Bax;C.Bcl-2蛋白水平的定量分析;D.Bax蛋白水平的定量分析。*P<0.05,**P<0.01,NS P>0.05

2.4 RAMPSt對(duì)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化的影響

Cr(Ⅵ)處理組線粒體膜電位下降顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(圖4),而RAMPSt干預(yù)后線粒體膜電位下降,較Cr(Ⅵ)處理組顯著降低(P<0.01)。

2.5 RAMPSt對(duì)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

Cr(Ⅵ)處理組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.01),RAMPSt干預(yù)后,細(xì)胞凋亡率較Cr(Ⅵ)處理組顯著降低(P<0.01)(圖5)。

2.6 RAMPSt對(duì)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組相比,Cr(Ⅵ)處理后Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),Bax表達(dá)顯著升高(P<0.05),RAMPSt組干預(yù)后后顯著抑制了Cr(Ⅵ)引起的Bcl-2蛋白表達(dá)水平的降低(P<0.05)及Bax蛋白表達(dá)水平的升高(P<0.01)(圖6)。

2.7 氧化應(yīng)激在Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用

添加抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)后,可以顯著抑制Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加(P<0.01); RAMPSt也可以顯著抑制Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加(P<0.01)(圖7A和圖7B);與對(duì)照組相比,Cr(Ⅵ)處理組的熒光強(qiáng)度顯著增多(圖7C),而NAC+Cr(Ⅵ)組和RAMPSt+Cr(Ⅵ)組與Cr(Ⅵ)處理組相比,熒光強(qiáng)度減少,結(jié)果表明ROS參與了Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,降低ROS的水平可以緩解Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的PK-15細(xì)胞凋亡。

A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS;B.ROS統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C.用Annexin V-FITC/PI雙染法熒光探針觀察細(xì)胞凋亡,*P<0.05,**P<0.01,NS P>0.05

2.8 RAMPSt對(duì)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)小鼠腎臟組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比,Cr(Ⅵ)處理后小鼠腎組織中ROS、MDA水平顯著升高(P<0.01),GSH、SOD水平顯著降低(P<0.01),RAMPSt組干預(yù)后抑制了Cr(Ⅵ)引起的ROS、MDA水平的升高和GSH、SOD水平的降低(圖8)。

圖8 小鼠腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

2.9 RAMPSt對(duì)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)小鼠腎臟組織的影響

與對(duì)照組相比,Cr(Ⅵ)組小鼠腎組織中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);而RAMPSt干預(yù)后Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)水平的降低(P<0.01)(圖9)。

A～B.Western blot檢測(cè)小鼠腎組織中Bcl-2和Bax蛋白;C～D.小鼠腎組織中Bcl-2和Bax蛋白定量分析,**P<0.01,NS P>0.05

3 討論

Cr(Ⅵ)通過(guò)食物鏈威脅公眾健康,腎臟是蓄積和排泄Cr(Ⅵ)的主要器官,通過(guò)篩選Cr(Ⅵ)致PK-15細(xì)胞損傷的濃度和時(shí)間,發(fā)現(xiàn)在12 h時(shí)Cr(Ⅵ)對(duì)PK-15細(xì)胞的IC50是40 μmol,因此選用Cr(Ⅵ)40 μmol和12 h作為本研究的試驗(yàn)濃度和作用時(shí)間。根據(jù)Cr(Ⅵ)的作用時(shí)間選擇RAMPSt的最佳作用濃度,最終選用40 μmol/mL 的Cr(Ⅵ)和200 μg/mL 的RAMPSt進(jìn)行共處理或者單獨(dú)處理12 h進(jìn)行試驗(yàn)。

多糖是中草藥中含量最為豐富的活性成分之一,植物多糖在緩解重金屬中毒方面效果很好[3]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了在PK-15細(xì)胞上探究RAMPSt對(duì)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。腎臟參與滲透調(diào)節(jié)和毒物的代謝導(dǎo)致組織病理學(xué)改變[4],選用小鼠作為動(dòng)物模型,觀察RAMPSt對(duì)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)小鼠腎氧化應(yīng)激及凋亡的作用。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)ROS與內(nèi)源性抗氧化防御失衡而引起的組織或細(xì)胞損傷狀態(tài)[5]。本研究證明RAMPSt能夠緩解Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生,且RAMPSt緩解了Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化,提高抗氧化酶GSH、SOD的活性。Cr(Ⅵ)處理誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激,表現(xiàn)為過(guò)氧化物酶活性顯著降低,MDA和SOD顯著升高[6]。在小鼠試驗(yàn)上,Cr(Ⅵ)可以引起小鼠腎臟組織中ROS、MDA的含量升高,GSH、SOD活性的降低,說(shuō)明Cr(Ⅵ)可以引起小鼠腎組織氧化損傷,添加RAMPSt可以緩解小鼠腎組織的氧化損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的穩(wěn)定代謝物。MDA是氧化反應(yīng)的主要副產(chǎn)物,被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的有效標(biāo)志物[7]。

線粒體負(fù)責(zé)許多基本的細(xì)胞功能,如新陳代謝、鈣(Ca2+)的調(diào)節(jié)、活性氧的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。線粒體功能障礙是包括癌癥在內(nèi)的許多病癥的基礎(chǔ)[8]。線粒體膜電位是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志,由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)。正常的線粒體膜電位是維持線粒體氧化磷酸化和ATP產(chǎn)生的先決條件。ROS產(chǎn)生的累積負(fù)擔(dān)可導(dǎo)致MMP分解,進(jìn)而導(dǎo)致能量缺乏和線粒體功能障礙[9]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Cr(Ⅵ)單獨(dú)處理會(huì)引起PK-15細(xì)胞線粒體膜電位的下降,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體的損傷和功能障礙,而RAMPSt可以緩解線粒體膜電位的下降,表明RAMPSt可以緩解線粒體損傷。細(xì)胞死亡過(guò)程中激活的許多促炎途徑發(fā)生在線粒體外膜通透化過(guò)程中,這是線粒體凋亡過(guò)程中細(xì)胞死亡的關(guān)鍵點(diǎn)[10]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cr(Ⅵ)可以誘導(dǎo)PK-15發(fā)生細(xì)胞凋亡,而RAMPSt與Cr(Ⅵ)共處理后,細(xì)胞凋亡率下降。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,BCL-2家族蛋白通過(guò)激活BAX和BAK以及阻斷抗凋亡BCL-2成員來(lái)促進(jìn)線粒體通透性[11]。蛋白質(zhì)印跡分析表明,Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax蛋白水平升高;Bcl-2蛋白水平降低,而RAMPSt減弱了線粒體凋亡通路信號(hào)蛋白的變化。caspase-3是線粒體依賴性細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵酶和主要執(zhí)行半胱天冬酶[12]。此外,Cr(Ⅵ)會(huì)誘導(dǎo)小鼠腎臟組織中Bax表達(dá)水平的升高和Bcl-2表達(dá)水平的降低,表明Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)了小鼠腎臟細(xì)胞的凋亡,而RAMPSt可以抑制Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)小鼠腎臟細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的主要模式,受許多促凋亡基因和抗凋亡基因的調(diào)節(jié)[13]。試驗(yàn)通過(guò)抗氧化劑NAC驗(yàn)證了清除ROS對(duì)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有緩解作用,RAMPSt有同樣的效果。這些結(jié)果都表明Cr(Ⅵ)能夠引起細(xì)胞凋亡及其小鼠腎損傷,而RAMPSt能夠通過(guò)清除線粒體中過(guò)量的ROS來(lái)緩解其造成的損傷作用。

綜上所述,RAMPSt通過(guò)清除過(guò)量的ROS,阻斷氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑發(fā)揮拮抗Cr(Ⅵ)致PK-15細(xì)胞和小鼠腎氧化應(yīng)激及凋亡的作用。RAMPSt是一種天然活性物質(zhì),作為Cr(Ⅵ)中毒的解毒劑提供重要的理論依據(jù)。