安裕智,孫 寧,孫鳳嬌,呂相龍,呂曉萍,劉超男,高雪麗

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

鐵(Fe)是動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行生理活動(dòng)必需的元素,在生物代謝過程中發(fā)揮重要作用[1]。鐵常以亞鐵(Fe2+)、鐵(Fe3+)的形式存在,具有很強(qiáng)的氧化還原性質(zhì)[2]。過量鐵具有極強(qiáng)的毒性,機(jī)體鐵超載會(huì)引起血色素沉著癥[3]、肝損傷和癌癥等[4-5]。雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 33-2004)規(guī)定:雛雞飼料中鐵最大耐受量為500 mg/kg。過量鐵可導(dǎo)致肉雞體重、生長性能、腹脂率和肉質(zhì)水平嚴(yán)重降低[6],但是過量鐵對雛雞免疫器官的影響研究較少。脾臟作為體內(nèi)最大的外周免疫器官,容易受到重金屬毒性影響[7],是鐵超載時(shí)主要靶器官之一。氧化應(yīng)激是指氧化劑的產(chǎn)生和抗氧化劑的防御之間的不平衡,可導(dǎo)致生物系統(tǒng)的損害[8]。試驗(yàn)證明,許多重金屬可使動(dòng)物組織中MDA、NO含量升高,GPx、CAT等抗氧化物質(zhì)減少或功能減弱,導(dǎo)致自由基聚集并引發(fā)疾病[9-10]。本研究通過對雛雞脾臟氧化與抗氧化功能的檢測,并結(jié)合病理組織學(xué)變化,探討過量鐵對雛雞脾臟的氧化應(yīng)激損傷機(jī)制,為鐵的合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 75只1日齡健康白羽肉雞,哈爾濱先鋒孵化場提供,自由飲食飲水,適應(yīng)性飼喂14 d。

1.1.2 主要試劑 丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)及鐵含量檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;普魯士藍(lán)染色試劑盒,索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;蘇木素染液、伊紅染液,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室提供;硫酸亞鐵(FeSO4·H2O),純度≥91.4%,四川龍蟒集團(tuán)產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(ELx808),美國Bio-Tek儀器有限公司產(chǎn)品;小型臺式冰凍離心機(jī)(Eppendorf 5430/R),艾本德中國有限公司產(chǎn)品;SCIENTZ-48L冰凍型高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品;輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(HM340E),MICROM國際股份有限公司產(chǎn)品;NIKON ECLIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡和NIS-Elements病理成像系統(tǒng),尼康儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物處理 將75只15日齡健康白羽肉雞隨機(jī)分為3組:對照組(Control)、鐵過量1組(E1)和鐵過量2組(E2);將硫酸亞鐵水合物(FeSO4·H2O)溶于水并和飼料充分?jǐn)嚢?分別在飼料中添加50、500和1000 mg/kg,連續(xù)飼喂3 d。于鐵過量后1、3、7、14、21 d各組隨機(jī)抽取5只雛雞,稱重,心臟采血致死,取脾臟,觀察大體形態(tài)并稱重。取部分脾臟置于100 mL/L中性福爾馬林固定,4℃保存,剩余脾臟分裝于-80℃保存。

1.2.2 檢測指標(biāo)及方法

1.2.2.1 鐵含量檢測 將40 mg脾臟放入裝有400 mL生理鹽水的EP管中,振蕩勻漿,取上清,按檢測試劑盒說明操作,測量520 nm吸光度值(OD值),并根據(jù)以下公式計(jì)算:

組織鐵含量(μmol/g)=(測定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測蛋白濃度(g/L)。

1.2.2.2 MDA及H2O2含量測定 將15 mg脾臟放入含有135 mL生理鹽水的EP管中,振蕩勻漿,取上清,按照試劑盒說明書檢測,分別在波長532 nm和405 nm測量MDA及H2O2吸光度值(OD值),并根據(jù)以下公式計(jì)算:

MDA含量(nmol/mg)=(測定OD值-對照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測蛋白濃度(nmol/mg)。

H2O2含量(nmol/g)=(測定OD值-對照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測蛋白濃度(nmol/g)。

1.2.2.3 CAT、GPx活力和T-AOC水平測定 將30 mg脾臟放入含有270 mL生理鹽水的EP管中,振蕩勻漿,取上清,按照試劑盒說明書檢測,分別在波長405 nm和520 nm下測量CAT、GPx吸光度和T-AOC吸光度值(OD值),并根據(jù)以下公式計(jì)算:

CAT活力(U/mL)=(對照OD值-測定OD值)×271/(60×取樣量)/待測樣品蛋白濃度(mg/mL)。

GPx活力(U/mg)=(非酶管OD值-酶管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度÷待測蛋白濃度。

T-AOC(U/mg)=(測定OD值-對照OD值)/0.3×(反應(yīng)液總量/取樣量)×勻漿蛋白液濃度(mg/mL)。

1.2.2.4 脾臟器官指數(shù) 記錄雛雞和脾臟重量,觀察大體形態(tài),根據(jù)公式計(jì)算脾臟器官指數(shù):脾臟指數(shù)=脾臟重量(g)/體重(kg)。

1.2.2.5 病理組織學(xué)觀察 脾臟經(jīng)10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、HE染色和普魯士藍(lán)染色。

1.2.2.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 9.5軟件進(jìn)行雙因素方差分析,并制作圖表,所有數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 雛雞鐵過量后脾臟鐵含量變化

鐵過量后1～14 d,雛雞脾臟鐵含量極顯著高于對照組雛雞(P<0.01);1～7 d后鐵過量2組雛雞脾臟鐵含量顯著或極顯著高于鐵過量1組(P<0.01或P<0.05)(圖1)。

*P<0.05,**P<0.01)

2.2 雛雞鐵過量后脾臟MDA及H2O2含量變化

鐵過量后1～21 d,除鐵過量1組14 d MDA含量無顯著變化外,雛雞脾臟MDA及H2O2含量均顯著或極顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05);鐵過量2組MDA及H2O2含量于鐵過量后1～14 d極顯著高于鐵過量1組(P<0.01)(圖2、圖3)。

**P<0.01)

*P<0.05,**P<0.01)

2.3 雛雞鐵過量后脾臟CAT、GPx和T-AOC變化

鐵過量后1～21 d,雛雞脾臟CAT、GPx活力和T-AOC水平均顯著或極顯著低于對照組(P<0.01或P<0.05 );鐵過量2組顯著或極顯著低于鐵過量1組(P<0.01或P<0.05)(圖4～圖6)。

*P<0.05,**P<0.01)

*P<0.05,**P<0.01)

*P<0.05,**P<0.01)

2.4 雛雞鐵過量后脾臟器官指數(shù)及眼觀病理變化

雛雞鐵過量2組脾臟指數(shù)1～3 d顯著或極顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05),僅在1 d顯著高于鐵過量1組(P<0.05)(圖7)。雛雞鐵過量后1～7 d,脾臟顏色暗紅、不同程度腫大或充血,1周后恢復(fù)正常(圖 8)。

*P<0.05,**P<0.01)

圖8 雛雞鐵過量后脾臟眼觀病理變化

2.5 雛雞鐵過量后脾臟病理組織學(xué)觀察

HE染色顯示,鐵過量2組脾臟組織細(xì)胞排列混亂,網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生。紅髓內(nèi)有散落的紅細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞,部分脾細(xì)胞及淋巴細(xì)胞皺縮。白髓和紅髓結(jié)構(gòu)模糊,白髓占比減少,紅髓占比增大。白髓脾小體變大且結(jié)構(gòu)模糊,淋巴細(xì)胞減少,動(dòng)脈周圍淋巴鞘顯著增厚(圖9C)。鐵過量1組脾臟動(dòng)脈周圍淋巴鞘顯著增厚,紅髓內(nèi)有紅細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞(圖9B)。普魯士藍(lán)染色顯示:兩組雛雞脾臟紅髓和白髓均有鐵血黃素,并且鐵過量2組藍(lán)染含鐵血黃素顆粒較1組增多(圖9E、9F)。

A、D.對照組;B、E.鐵過量1組;C、F.鐵過量2組。A～C.HE 400×;“→”,脾小體;D～F.Perls 200×;“↑”,含鐵血黃素沉積

3 討論

鐵過量后,雛雞脾鐵含量顯著升高,脾急性腫脹。鐵過量后雛雞脾臟組織結(jié)構(gòu)損傷,細(xì)胞排列混亂。紅髓內(nèi)出現(xiàn)散落的紅細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞,動(dòng)脈周圍淋巴鞘顯著增厚,說明脾臟遭遇抗原刺激引起免疫應(yīng)答。雛雞攝入過量鐵后,白髓占比減少,脾小體數(shù)量增多,且結(jié)構(gòu)模糊,淋巴細(xì)胞數(shù)量減少,機(jī)體免疫功能下降。普魯士藍(lán)染色顯示鐵過量后,雛雞脾臟紅髓分布有藍(lán)染含鐵血黃素,且隨鐵劑量的增加含鐵血黃素分布越廣泛。以上結(jié)果證明脾臟吸收鐵的能力有限,雛雞攝入過量鐵后,鐵會(huì)在脾臟中沉積并造成組織結(jié)構(gòu)損傷,進(jìn)而影響脾臟免疫功能。

綜上所述,攝入過量鐵后,雛雞脾臟MDA、H2O2含量升高,CAT、GPx活力、T-AOC水平降低,表明過量鐵可致雛雞脾臟氧化水平升高,抗氧化能力下降,機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。脾臟作為體內(nèi)最大的外周免疫器官,是鐵超載時(shí)的靶器官之一,鐵過量后,脾小體數(shù)量增多且結(jié)構(gòu)模糊,組織結(jié)構(gòu)損傷,過量鐵通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致脾臟組織損傷,從而影響脾臟免疫功能。