曾 臻，羅家英，蔡依婕，上官雪茹，黃藝虹，李雅婷，李婉褀，譚強來

（廈門醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361023）

自20 世紀(jì)人們發(fā)現(xiàn)青霉素以來，抗生素便被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、養(yǎng)殖生產(chǎn)等行業(yè)。然而抗生素濫用的弊端日益顯現(xiàn)，抗生素耐藥性嚴(yán)重對公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重影響，同時造成環(huán)境污染等問題，威脅人們的健康。相較于傳統(tǒng)抗生素，抗菌肽是一類在生物體廣泛存在的小分子生物活性肽，由先天性免疫防御系統(tǒng)在抵御外來病原微生物侵染時產(chǎn)生，多在12~50 個氨基酸之間[1]。由于抗菌肽種類多、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性，對細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲乃至癌細(xì)胞均可有效抑制或殺傷，應(yīng)用前景廣闊[2]。

鱟抗菌肽是鱟在抵御外源病原體侵襲過程中的天然防御系統(tǒng)之一[3]。目前已發(fā)現(xiàn)5 種，其中3 種來源于中國鱟，分別為Tachyplesin I、Tachyplesin II、Tachyplesin Ⅲ，由17 個氨基酸組成；另外2 種來源于美洲鱟，分別為Polyphemusins I、Polyphemusins II，由18 個氨基酸組成[4]。其中，Tachyplesin II 表現(xiàn)出優(yōu)良的抑菌活性。Xu 等[5]曾選取36 株真菌和細(xì)菌用于Tachyplesin II 的抑菌活性測定，結(jié)果表明26 株真菌和細(xì)菌的生長被有效抑制。然而，天然抗菌肽提取量低，通過基因工程可實現(xiàn)大量制備以應(yīng)用于實際生產(chǎn)。相較于大腸桿菌，畢赤酵母具有更好的表達(dá)后加工修飾能力，有助于保持重組蛋白的生物學(xué)活性[6]。因此，本研究擬通過串聯(lián)表達(dá)以期實現(xiàn)高產(chǎn)，為高效制備鱟抗菌肽Tachyplesin Ⅱ奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

畢赤酵母X-33 和表達(dá)載體pPICZαA（本實驗室保存）；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶（生工生物工程（上海）股份有限公司）；Zeocin 博來霉素（美國英杰生命技術(shù)有限公司）；BMGY/BMMY培養(yǎng)基（上海瑞楚生物科技有限公司）；彩虹180 廣譜蛋白Marker、Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、YPD 培養(yǎng)基、無氨基酵母氮源（YNB）、生物素和山梨醇（北京索萊寶科技有限公司）；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、PCR 擴增儀、凝膠成像分析儀（美國伯樂）；電轉(zhuǎn)化儀（德國艾本德股份公司）；超凈工作臺（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器（上海蘇坤實業(yè)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 四聯(lián)鱟抗菌肽Tachyplesin Ⅱ（4TpⅡ）序列的設(shè)計

查詢抗菌活性及多肽結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Database of Anti microbial Activity and Structure of Peptides，DBAAS P），獲得鱟抗菌肽Tachyplesin Ⅱ的氨基酸序列；選用含α-factor 的畢赤酵母蛋白分泌表達(dá)載體pPICZαA，以利于高水平的分泌表達(dá)。選用X-33 畢赤酵母表達(dá)菌，以適于含Zeocin 抗性的pPICZαA 重組質(zhì)粒的表達(dá)。參考Li等[7]的方法，根據(jù)胰彈性蛋白酶（-Ala↓或-Gly↓）和羧肽酶A（裂解C 末端氨基酸）的特異性裂解位點，設(shè)計四聯(lián)鱟抗菌肽Tachyplesin Ⅱ（4TpⅡ）序列；根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化；根據(jù)4TpⅡ和pPICZαA的堿基序列特點，設(shè)計相應(yīng)酶切位點。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

參考譚強來等[8]的方法，利用ExPASy 數(shù)據(jù)庫工具包分析4TpⅡ的基本理化性質(zhì)。

1.3.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-4TpⅡ

4TpⅡ序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行全基因合成。然后，用EcoRⅠ和NotⅠ對4TpⅡ和pPICZαA 雙酶切，然后T4 DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用Zeocin 抗性LB 平板篩選，并通過酶切和測序驗證重組質(zhì)粒pPICZαA-4TpⅡ是否成功構(gòu)建，構(gòu)建策略如圖1 所示。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZαA-4TpⅡ構(gòu)建示意圖

1.3.4 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33 及篩選陽性轉(zhuǎn)化子

參考譚強來等[9]的方法，用SacI 酶切線性化pPIC ZαA-4TpⅡ，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33，條件為：0.2 cm 電轉(zhuǎn)杯（預(yù)冷）、1 500 V、25 μF 和400 Ω。電擊后立即加入1 mol/L 山梨醇（預(yù)冷），涂布Zeocin 抗性YPD 平板，30 ℃培養(yǎng)至單菌落長出，以pPICZαA 空載體同上處理作為陰性對照。

1.3.5 重組蛋白4TpⅡ的誘導(dǎo)表達(dá)篩選

選取若干個陽性轉(zhuǎn)化子于YPD 中活化，然后轉(zhuǎn)接于BMGY，30 ℃、250 r/min 培養(yǎng)至菌液OD600≈3，離心收集菌體后用含1%甲醇的BMMY 重懸，誘導(dǎo)表達(dá)5 d，每隔24 h 補加甲醇至終濃度1%，第5 天離心5 min 收集上清，SDS-PAGE 分析。用含pPICZαA 空載體的酵母轉(zhuǎn)化子同上處理作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 四聯(lián)鱟抗菌肽Tachyplesin Ⅱ（4TpⅡ）的設(shè)計

獲取鱟抗菌肽Tachyplesin Ⅱ的氨基酸序列（RWC FRVCYRGICYRKCR），設(shè)計四聯(lián)鱟抗菌肽TachyplesinⅡ（4TpⅡ）序列（MARWCFRVCYRGICYRKCRARWCF RVCYRGICYRKCRARWCFRVCYRGICYRKCRARWCF RVCYRGICYRKCRAHHHHHH），中間嵌入胰彈性蛋白酶（-Ala↓或-Gly↓）和羧肽酶A（裂解C 末端氨基酸）的特異性裂解位點。5′端含EcoRⅠ酶切位點和起始密碼子ATG（Met，pPICZαA 插入基因所必需），3′端含6×His 標(biāo)簽、終止密碼子TAA 和NotⅠ酶切位點。

2.2 4TpⅡ的畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化

4TpⅡ經(jīng)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化如圖2 所示。經(jīng)優(yōu)化后的4TpⅡ密碼子相對頻率雷達(dá)圖的曲線匹配較好，最優(yōu)密碼子頻率增加，GC 含量適宜（39.1%），無重復(fù)序列。

圖2 4TpⅡ的畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化

2.3 4TpⅡ的生物信息學(xué)分析

4TpⅡ的基本理化參數(shù)見表1，預(yù)期氨基酸數(shù)量為74 個，分子量為9 507.61 Da，等電點為10.23，僅帶正電荷，殘基總數(shù)為24 個，較為穩(wěn)定，酵母體內(nèi)半衰期大于20 h，推測適于畢赤酵母表達(dá)。4TpⅡ的氨基酸親疏水性分析如圖3 所示，最大值為0.6（第5 位氨基酸），最小值為-2.48（第73 位氨基酸）。

表1 4TpⅡ的基本理化參數(shù)分析

2.4 重組質(zhì)粒pPICZαA-4TpⅡ的驗證

對重組質(zhì)粒pPICZαA-4TpⅡ進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖4 所示，表明重組質(zhì)粒pPICZαA-4TpⅡ構(gòu)建成功，并經(jīng)測序驗證無堿基和氨基酸突變。

圖4 重組質(zhì)粒pPICZαA-4TpⅡ的鑒定

2.5 重組蛋白4TpⅡ的誘導(dǎo)表達(dá)篩選

選取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行重組蛋白4TpⅡ的誘導(dǎo)表達(dá)篩選，結(jié)果如圖5 所示，1 號轉(zhuǎn)化子的泳道清晰，在17~20 kDa 處有一個明顯的條帶，而陰性對照的泳道則無此條帶，表明重組蛋白4TpⅡ表達(dá)成功。但電泳測定的分子量比生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果偏高，與張亞莉等[10]得出的結(jié)果相似，推測可能原因，一是4TpⅡ分子量小且?guī)д姾蓺埢倲?shù)多，SDS-PAGE 電泳時遷移變慢；二是生物信息學(xué)預(yù)測時無法考慮蛋白質(zhì)翻譯后修飾等，導(dǎo)致分子量預(yù)測偏小。

圖5 重組蛋白4TpⅡ的誘導(dǎo)表達(dá)篩選

3 結(jié)論與討論

抗菌肽不僅具有較廣泛的微生物殺滅作用，還常存在重要的免疫及非免疫功能，是替代抗生素解決其耐藥性的有效方案之一[11]。鱟抗菌肽分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、不易產(chǎn)生耐藥性，在食品醫(yī)藥等領(lǐng)域扮演重要角色。有研究表明，Tachyplesin Ⅰ可拮抗枯草桿菌和隱球菌，還能有效抑制肝癌細(xì)胞的生長[12-13]。Tachyplesin II 的細(xì)胞毒性較低、抗菌譜廣，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、畜牧水產(chǎn)業(yè)[14]。

直接提取或化學(xué)合成抗菌肽成本高、產(chǎn)量低，無法滿足實際需要，利用基因工程菌高效制備勢在必行，而畢赤酵母操作簡單、營養(yǎng)要求低，是高密度發(fā)酵和大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)先選擇[15]。王蓮哲等[16]利用表達(dá)載體pPIC9K和畢赤酵母GS115，成功表達(dá)樹蛙抗菌肽Cathelicidin。Li 等[7]則利用pGAPZαB 和畢赤酵母GS115，通過串聯(lián)表達(dá)的方式高效制備了Tachyplesin I。

本研究基于畢赤酵母密碼子偏好性和生物信息學(xué)分析，成功設(shè)計4TpⅡ序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-4TpⅡ；篩選到1 株重組畢赤酵母X-33/pPICZαA-4TpⅡ，經(jīng)30 ℃、250 r/min、1%甲醇誘導(dǎo)5 d 后，分泌表達(dá)出重組蛋白，為高效制備鱟抗菌肽Tachyplesin Ⅱ奠定基礎(chǔ)。后續(xù)將優(yōu)化表達(dá)和純化條件，為基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽提供了可資參考的技術(shù)途徑。