何敏慧 高 泓 謝紅艷 謝春光△

研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)血管內(nèi)皮損傷后,雖然周圍的成熟內(nèi)皮細(xì)胞可通過分裂增殖對其進(jìn)行修復(fù),但這一作用非常有限,而EPCs才是發(fā)揮血管內(nèi)皮損傷修復(fù)的主要力量[1],EPCs通過動員、歸巢、轉(zhuǎn)化等一系列過程完成血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)[2]。調(diào)控EPCs干預(yù)糖尿病大血管損傷進(jìn)程的思路成為近年研究熱點。研究發(fā)現(xiàn),通過提高EPCs數(shù)量和功能,可以有效改善糖尿病大血管損傷[3]。參芪復(fù)方由人參、黃芪、生地黃、天花粉、山萸肉、丹參、制大黃組成,具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀的功效;臨床應(yīng)用20余年,是具有糖尿病大血管保護(hù)作用的臨床有效驗方[4]?，F(xiàn)代藥理研究證實參芪復(fù)方中大補元氣的人參、黃芪,祛瘀生新的丹參對活化EPCs有重要意義,在其他復(fù)方對EPCs研究中,也證實滋陰調(diào)脾補腎的山藥、山萸肉、生地黃占有重要席位[5]。為了明確研究參芪復(fù)方是否對能夠保護(hù)血管內(nèi)皮的EPCs具有促進(jìn)和保護(hù)的作用,本實驗擬采用離體實驗的研究方法,觀察高糖環(huán)境下大鼠骨髓源性EPCs的遷移、增殖作用。

1 材料

1.1 動物選擇體質(zhì)量120～140 g SD(Sprague-Dawley)大鼠,SFP(Specific pathogen free)級,本實驗SD大鼠均于成都達(dá)碩生物科技有限公司處購買,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2020-0030。

1.2 藥物D-(+)葡萄糖(sigma,德國,批號:LC26022V);參芪復(fù)方中藥飲片由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供,參芪復(fù)方凍干粉由四川百草精工生物科技有限公司加工。

1.3 試劑EGM-2培養(yǎng)基(lonza,美國,批號:0001056859);Histopque-1083(sigma,德國,批號:RNBJ9540);FN(MCE,中國,批號:103747);Anti-CD34 antibody(abcam,英國, 批號:GR3240236-18);Anti-VEGF Receptor 2 antibody(abcam,英國,批號:GR3320191-9);CCK-8試劑盒(biosharp ,中國,批號:BS350B);結(jié)晶紫(碧云天,中國) ;Transwell(Corning,美國,批號:15421051)。

1.4 儀器流式細(xì)胞儀(Thermo Fisher Scientific,美國);低速冷凍離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司,中國);二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司,中國);熒光顯微鏡(奧靈巴斯,日本);酶標(biāo)儀(biobase,中國)。

1.5 方法

1.5.1 參芪復(fù)方含藥血清制備將適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后的12只體質(zhì)量(200±20)g的SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組,各6只:①含藥血清組:以參芪復(fù)方凍干粉灌胃1.44 kg·d,每天2次,連續(xù)灌藥7 d;②空白血清組:用等量的生理鹽水灌胃,每天2次,連續(xù)7 d。末次給藥1 h后,取血,離心,除菌,滅活,無菌分裝,放置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 EPCs的培養(yǎng) 鑒定大鼠麻醉處死后,取股骨、脛骨剪破,用PBS反復(fù)沖洗髓腔(操作保持無菌);細(xì)胞懸液用70 um Filter Unit過濾后,按1∶1的比例將Histopque-1083分離液與細(xì)胞懸液先后加入15 ml離心管中,離心,2000 r/min,20 min;取出中間云霧層的單個核細(xì)胞,用EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,1500 r/min離心10 min,操作2次;把細(xì)胞懸液接種FN包被的六孔板中,48～72 h進(jìn)行第1次換液,從第2次換液起,每2～3 d換液1次,7～9 d可進(jìn)行傳代。

收集純化后的原代EPCs,再用預(yù)冷的流式緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個/ml,將細(xì)胞懸液加入流式管中。再將Anti-CD34抗體(ab8158)、Anti-VEGF Receptor 2抗體(ab2349)加入流式管中,4 ℃避光孵育1 h。之后取400 g,離心5 min,然后重懸于冰冷的流式緩沖液,加入二抗,4 ℃避光孵育30 min。再取400 g,離心5 min,重懸于冰冷的流式緩沖液,進(jìn)行洗滌,重復(fù)3次。上流式細(xì)胞儀分析。

1.5.3 構(gòu)建高糖模型①分組。EGM-2培養(yǎng)基含糖5.5 mmol/L,將本底EGM-2培養(yǎng)基設(shè)為contrrol組;添加葡萄糖,用EGM-2培養(yǎng)基配制成含糖15 mmol/L、25 mmol/L、35 mmol/L、45 mmol/L、55 mmol/l培養(yǎng)基組[6]。按照分組提前備好含不同濃度葡萄糖的EGM-2培養(yǎng)基。②EPCs遷移能力檢測。首先分別在上室和下室中加入100 μl和600 μl EGM-2培養(yǎng)基于溫箱中平衡1 h,收集細(xì)胞后, 將EPCs用EGM-2培養(yǎng)基重懸,并計數(shù)。將平衡后的小室取出后去除培養(yǎng)基,按分組在上室中加密度為15000個/100 μl,200 μl細(xì)胞懸液,下室加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,先將小室用4%多聚甲醛固定30 min,再用結(jié)晶紫染色,最后用PBS浸洗3遍,于倒置顯微鏡下任選5個視野觀察,計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。③EPCs活性增殖能力檢驗。用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞,用EGM-2培養(yǎng)基重懸,并計數(shù),按8000個/孔的密度接種至 96 孔板中,每孔100 μl EGM-2培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱中過夜使細(xì)胞貼壁。根據(jù)分組分別換用上述正常培養(yǎng)基及含糖培養(yǎng)基,至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8 10 μl,避光孵育1 h后,酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(OD)值。

1.5.4 不同濃度參芪復(fù)方血清對高糖環(huán)境下EPCs增殖 遷移影響①分組及干預(yù)。選擇45 mM高糖刺激24 h后,1組設(shè)為control組,加入45 mM高糖+EGM-2培養(yǎng)基,其余3組分別在45 mM高糖+EGM-2培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入終濃度為(5%、10%、15%)的參芪復(fù)方血清。分別培養(yǎng)24、48 h。按照分組提前備好含不同濃度參芪復(fù)方血清的高糖培養(yǎng)基。②EPCs遷移能力檢測。③EPCs活性增殖檢驗。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的鑒定通過流式細(xì)胞儀檢測原代細(xì)胞培養(yǎng)至第11天表面標(biāo)志物CD34和VEGFR-2的表達(dá),所測細(xì)胞共同表達(dá)CD34、VEGFR-2的細(xì)胞占總細(xì)胞的96.4%。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞檢測原代細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34/VEGFR-2

2.2 不同濃度葡萄糖刺激下EPCs遷移能力各組細(xì)胞隨著葡萄糖濃度的升高,細(xì)胞從上室遷移至下室的EPCs比例逐漸減少,正常培養(yǎng)基含糖量5.5 mM,作為contrrol組。與control組比15～55 mM遷移能力遞減,其中55 mM濃度時抑制最明顯(P<0.0001)。見圖2。

(注:****表示P<0.0001)

2.3 不同濃度葡萄糖刺激下EPCs活性增殖能力EPCs在不同濃度葡萄糖刺激24 h后,通過CCK-8檢測其活性增殖能力,顯示隨著葡萄糖濃度的升高,對其的抑制率也越來越高,其IC50=37.43。與control組比55 mM組抑制率最高。EPCs的增殖活性與葡萄糖濃度成負(fù)相關(guān)。見圖3。

圖3 不同濃度葡萄糖對EPCs的抑制

得知葡萄糖濃度與EPCs的遷移能力、增殖活性為負(fù)相關(guān),選擇45 mM高糖細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)實驗;本實驗中葡萄糖對 EPCs的半數(shù)抑制率的有效濃度在37.43 mM,在45 mM時,與control組比,EPCs的遷移能力被抑制了80%左右,且45 mM、55 mM的遷移抑制,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);結(jié)合高糖環(huán)境下EPCs增殖、遷移能力分析,45 mM是適合探究高糖環(huán)境對EPCs造成損傷的濃度。

2.4 高糖環(huán)境下不同濃度參芪復(fù)方血清對EPCs遷移能力影響在Transwell實驗中EPCs在45 mM高糖刺激+參芪復(fù)方血清干預(yù)24 h及48 h后。結(jié)果顯示:參芪復(fù)方可以一定程度恢復(fù)高糖對EPCs的遷移能力的抑制。高糖刺激+5%參芪復(fù)方血清干預(yù)24 h后,對EPCs的遷移能力改善最佳。見圖4。

(注:****表示P<0.0001,***表示P<0.001,**表示P<0.005,*表示P<0.05)

2.5 高糖環(huán)境下不同濃度參芪復(fù)方血清對EPCs增殖能力的影響髓源EPCs在45 mM高糖刺激24 h后,用5%、10%、15%的參芪血清干預(yù)24、48 h后。結(jié)果顯示:不同濃度參芪復(fù)方干預(yù)高糖環(huán)境下EPCs 24、48 h后,EPCs增殖能力均有所改善;干預(yù)48 h較24 h,改善更明顯,且干預(yù)48 h時,5%參芪復(fù)方濃度作用最佳。見圖5。

(注:****表示P<0.0001,***表示P<0.001,**表示P<0.005)

3 討論

EPCs作為保護(hù)血管內(nèi)皮的重要角色,主要來源于骨髓;EPCs不同于其他祖細(xì)胞,而與干細(xì)胞相似,具有自我更新和多種分化的潛能[7,8]。1997年Asahara等人從外周血循環(huán)中分離出EPCs[9,10],并證實EPCs是參與血管生成的未分化細(xì)胞。當(dāng)人體受到外傷、缺血、缺氧等外界環(huán)境刺激時,EPCs會從骨髓動員、遷移到循環(huán)血液中,參與受損組織的修復(fù)和再生[11]。多項證據(jù)表明糖尿病(DM)中EPCs數(shù)量減少和EPCs功能的各個方面受損, EPCs的功能改善可以使DM患者受益[12,13]。目前已經(jīng)進(jìn)行了使用 EPCs治療缺血性心臟病和嚴(yán)重外周動脈疾病的臨床試驗[14,15],但通過恢復(fù)EPCs的功能治療DM或是通過正常EPCs治療DM及其并發(fā)癥的臨床證據(jù)較少。通過恢復(fù)EPCs功能治療DM具有巨大潛力。

通過課題組前期對糖尿病大血管并發(fā)癥多維度的研究,臨床隨機(jī)對照試驗證明參芪復(fù)方能夠有效改善DM患者血糖控制水平[16]、調(diào)節(jié)血脂、顯著提高患者生活質(zhì)量,并在改善DM患者胰島β細(xì)胞功能、增加餐GLP-1分泌、調(diào)節(jié)腸道菌群、改善微循環(huán)、降低DM患者炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平、修復(fù)患者血管內(nèi)皮損傷等各個方面發(fā)揮積極作用,能夠有效防控糖尿病大血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[17]。參芪復(fù)方,用人參、黃芪以升陽運脾、補中益氣,營衛(wèi)同守,血脈同固,助脾布散水谷精微,以升清降濁,補后天以養(yǎng)先天;用天花粉、生地黃以滋陰降火,共養(yǎng)肺脾腎陰,蓄真水之虧;山藥、山茱萸以健脾溫腎、養(yǎng)陰益氣;用酒制大黃、丹參以活血化濁、祛瘀生新。方中黃芪與山藥相配,補氣升陽助脾復(fù)運,天花粉與生地黃、山藥相配,肺脾腎及三焦之陰虧得以滋補,內(nèi)蘊之火可以通降,全方君臣佐使相宜,養(yǎng)陰益氣,活血化瘀,從而防止糖尿病大血管損傷。

EPCs的遷移與數(shù)量直接關(guān)系到修復(fù)內(nèi)皮損傷的血管新生與血管形成[18]。提高高糖環(huán)境下EPCs的增殖、遷移是EPCs能否順利完成糖尿病大血管并發(fā)癥血管損傷修復(fù)的關(guān)鍵之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),參芪復(fù)方干預(yù)高糖環(huán)境下EPCs 24、48 h時,均可改善EPCs增殖,與其濃度呈負(fù)相關(guān)。在參芪復(fù)方干預(yù)高糖環(huán)境下的EPCs 24 h時,對增殖、遷移均有改善,且參芪復(fù)方血清5%為最佳;當(dāng)干預(yù)48 h時,同是5%對增殖能力的改善最佳,而各組遷移能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義;改善高糖環(huán)境下EPCs增殖活性而言,干預(yù)48 h的組皆優(yōu)于干預(yù)24 h的組。綜上,參芪復(fù)方可以明顯改善高糖環(huán)境下EPCs的遷移能力、增殖活性。提示參芪復(fù)方治療糖尿病大血管并發(fā)癥可能還與其改善EPCs的遷移能力、增殖活性有關(guān)。同時也為臨床從改善 EPCs 功能角度治療糖尿病血管并發(fā)癥提供了新的思路。