陳宇 駱學新

[摘要]?目的?通過網(wǎng)絡藥理和分子對接方法，探究半枝蓮治療惡性胸腔積液（malignant?pleural?effusion，MPE）的作用機制。方法?利用IBW?SPSS?Modeler?18.0軟件對紹興第二醫(yī)院中醫(yī)科門診治療MPE處方信息進行數(shù)據(jù)挖掘，使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺篩選半枝蓮有效活性成分，利用GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取MPE疾病靶點，通過Cytoscape3.9.1軟件構建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡圖。利用DAVID在線平臺生成基因本體（gene?ontology，GO）功能富集分析圖和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路富集分析圖。使用PyMol和AutoDock?vina軟件將半枝蓮有效活性成分與核心靶點蛋白進行分子對接驗證。結果?半枝蓮治療MPE的主要活性成分有18種，其中黃芩黃酮、3-甲基鼠李素、薺苧黃酮、黃芩素、木犀草素等為主要活性成分，EGFR、AKT1、HIF1A、SRC等為核心靶點蛋白。結論?半枝蓮通過多成分、多靶點作用于MPE，為進一步研發(fā)MPE治療藥物提供理論基礎和新的切入點。

[關鍵詞]?半枝蓮；惡性胸腔積液；網(wǎng)絡藥理學；分子對接技術

[中圖分類號]?R285??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.016

Network?pharmacology?and?molecular?docking?of?the?Sculellaria?barbata?in?the?treatment?of?malignant?pleural?effusion

CHEN?Yu1，?LUO?Xuexin2

1.The?Second?School?of?Clinical?Medicine，?Zhejiang?Chinese?Medical?University，?Hangzhou?310053，?Zhejiang，?China;?2.Traditional?Chinese?Medicine?Department，?Shaoxing?Second?Hospital，?Shaoxing?312000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?mechanism?of?Scutellaria?barbata?in?treating?malignant?pleural?effusion?（MPE）?through?network?pharmacology?and?molecular?docking?methods.?Methods?Using?IBW?SPSS?Modeler?18.0?software?to?data?mine?the?malignant?pleural?effusion?prescription?information?in?the?Outpatient?Department?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Shaoxing?Second?Hospital.?Using?the?Chinese?medicine?system?pharmacology?database?and?analysis?platform?screening?lotus?effective?active?ingredients?and?related?targets，?malignant?pleural?effusion?disease?targets?in?GeneCards，?OMIM，?DisGeNET?database，?the?network?diagram?of?“TCM-component-target”?was?constructed?through?Cytoscape3.9.1?software.?The?DAVID?online?platform?was?used?to?generate?the?gene?ontology?（GO）?and?functional?enrichment?analysis?map?and?the?pathway?enrichment?analysis?map?of?Kyoto?Encyclopedia?of?Gene?and?Genomes?（KEGG）.?Using?PyMol?and?AutoDock?vina?software?to?test?the?molecular?docking?of?the?active?components?with?core?target?proteins.?Results?There?are?18?main?active?ingredients?in?the?treatment?of?MPE?with?Scutellaria?barbata，?among?which?baicalin，?3-methylrhamnosum，?shepherds?purse?flavonoids，?baicalin，?luteolin，?etc.?are?the?main?active?ingredients，?and?EGFR，?AKT1，?HIF1A，?SRC，?etc.?are?the?core?target?proteins.?Conclusion?Banzhilian?acts?on?malignant?pleural?effusion?through?multiple?components?and?targets，?providing?a?theoretical?basis?and?new?entry?point?for?the?further?development?of?drugs?for?the?treatment?of?malignant?pleural?effusion.

[Key?words]?Sculellaria?barbata;?Malignant?pleural?effusion;?Network?pharmacology;?Molecular?docking?technology

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮的干燥全草，性寒，味辛、苦，歸肺、肝、腎經，主要化學成分為黃酮類、多糖類、二萜類等，主要功效為清熱解毒、化瘀利尿[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明半枝蓮中的黃酮類成分具有多種藥理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎等，是潛在的天然抗氧化劑，臨床應用前景廣泛[2]。

惡性胸腔積液（malignant?pleural?effusion，MPE）是指原發(fā)于胸膜的惡性腫瘤或其他惡性腫瘤轉移至胸膜而引起的胸腔積液[3]。在我國MPE的發(fā)生率約占胸腔積液的29.6%[4]。多項研究表明半枝蓮對MPE具有有效治療作用。MPE患者機體處于氧化應激狀態(tài)，MPE的形成與過量自由基引起脂質過氧化使毒性液體滲入胸膜腔有關[5-6]。半枝蓮具有較強的抗氧化作用，可有效清除1–二苯基–2–三硝基苯肼、2–聯(lián)氮–二銨鹽等自由基[7]。金志超[8]以半枝蓮、葶藶子等自擬中藥消水方，通過實驗發(fā)現(xiàn)消水方可減少MPE模型小鼠的MPE生成量，延長小鼠的生存時間。李佩文經過長期臨床實踐，認為半枝蓮具有化瘀利水、抗腫瘤的功效，可有效治療MPE[9]。沈敏鶴善用半枝蓮、沙參、麥冬等為基礎方治療MPE，起到養(yǎng)肺陰而不戀邪，消懸飲而不傷正的功效[10]。因此探測半枝蓮對MPE的有效藥物成分及作用潛力對后續(xù)藥物研發(fā)具有重要意義。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術，將半枝蓮主要藥物活性成分與MPE核心靶點進行對接分析，為深入研究半枝蓮治療MPE提供新思路和理論依據(jù)。

1??資料與方法

1.1??數(shù)據(jù)挖掘

選取2021年1月至2023年1月就診于紹興第二醫(yī)院駱學新中醫(yī)門診的MPE患者96例。其中男38例、女58例，平均年齡（51.36±13.29）歲。利用IBW?SPSS?Modeler?18.0軟件進行數(shù)據(jù)挖掘；利用Excel軟件對收集的處方進行中藥頻數(shù)分析。

1.2??半枝蓮成分收集與篩選

以“半枝蓮”或“banzhilian”為關鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional?Chinese?Medicines?Systems?Pharmacology?Platform，TCMSP）查詢半枝蓮的化學成分。首先以生物利用度（oral?bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件進行篩選，再利用Swiss?ADME平臺以胃腸道吸收得分為“high”，類藥性至少通過2個“Yes”為條件篩選藥物活性成分。

1.3??MPE疾病靶點的收集

在GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中以“Malignant?Pleural?Effusion”為關鍵詞，檢索并篩選MPE作用的相關基因。

1.4??半枝蓮活性成分-MPE靶點網(wǎng)絡構建

利用Venny?2.1在線工具對藥物活性成分和疾病靶點基因取交集，得到共同靶點交集基因。將其導入STRING在線數(shù)據(jù)庫，構建交集靶點蛋白相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網(wǎng)絡圖。使用Cytoscape3.9.1軟件對PPI網(wǎng)絡進行可視化分析，篩選出核心靶點，并繪制“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖。

1.5??京都基因與基因組百科全書通路富集與基因本體生物過程分析

利用DAVID在線平臺對共同靶點交集基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路分析和基因本體（gene?ontology，GO）分析（P<0.05為篩選條件），對KEGG通路富集進行可視化分析并繪制氣泡圖，GO分析按基因數(shù)進行可視化分析并繪制氣泡圖。

1.6??分析對接驗證

利用AutoDock?vina軟件，將1.4項中的藥物活性成分進行拓撲分析，篩選出度值排名前5位的活性成分與篩選出的MPE核心靶點進行分子對接。

2??結果

2.1??中藥頻數(shù)分析

96首治療MPE中藥方中共有134味藥，使用頻率排名前6的中藥見表1，其中使用頻次最高的中藥為半枝蓮。

2.2??半枝蓮活性成分的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以OB≥30%和DL≥0.18為篩選標準，且利用Swiss?ADME平臺以GI?absorption得分為“high”，DL至少通過2個“Yes”作為篩選條件，得到18條半枝蓮有效活性成分，見表2。

2.3??靶點基因的收集和整理

選取在GeneCards數(shù)據(jù)庫中>中位數(shù)6.3的MPE靶點基因，合并OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中靶點基因，共得到879條MPE相關靶點基因。

2.4??構建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡

根據(jù)半枝蓮藥物活性成分和MPE相關靶點繪制韋恩圖，獲取87個共同靶點基因，即半枝蓮治療MPE的潛在靶點。通過Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡進行可視化分析，根據(jù)度值排名發(fā)現(xiàn)半枝蓮治療MPE的核心靶點可能是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/?threonine-protein?kinase，AKT1）、表皮生長因子受體（epidermal?growth?factor?receptor，EGFR）、非受體酪氨酸激酶（sarcoma?receptor?coactivator，SRC）、腫瘤缺氧信號通路的中樞因子（hypoxia?inducible?factor?1-alpha，HIF1A）等，并繪制核心靶點篩選過程，見圖1。將半枝蓮有效活性成分與共同靶點基因匹配，繪制“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡圖，見圖2。結果顯示半枝蓮通過多成分、多靶點作用于MPE。

2.5??生物功能和通路富集分析

GO分析結果顯示半枝蓮作用于MPE靶基因的生物過程（biological?progress，BP）主要涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、蛋白質自磷酸化等，見圖3。分子功能（molecular?function，MF）主要涉及三磷酸腺苷結合、蛋白酪氨酸激酶活性等，見圖4。細胞組成（cellular?component，CC）主要涉及胞外區(qū)、大分子復合物、核質等，見圖5。KEGG通路富集結果見圖6，通路主要包括癌癥通路、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol?3?kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein?kinase?B，Akt?）信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路等，提示以上可能是半枝蓮作用于MPE的主要通路。

2.6??分子對接驗證

將黃芩黃酮、3-甲基鼠李素、薺苧黃酮、黃芩素、木犀草素分別與AKT1、EGFR、SRC、HIF1A進行分子對接。所有對接結果結合能均<-5，對接結果較好，其中分子對接結果較好的有薺苧黃酮與AKT1（結合能-5.81）、3-甲基鼠李素與EGFR（結合能-5.4）等。分子對接三維結果見圖7和圖8，分子對接表面模型見圖9和圖10。此結果進一步確認了網(wǎng)絡藥理預測結果的置信度。

3??討論

MPE在中醫(yī)屬于“懸飲”“癖飲”等范疇[11]?！督饏T要略》記載：“飲后水流脅下，咳唾引痛，謂之懸飲?！彪m然MPE的診療日趨精準，但目前的藥物治療仍存在單靶點、單通路、毒副作用、耐藥等問題。因此，尋求多靶點、多途徑、低副反應、療效確切的抗腫瘤藥物或方法是目前MPE的研究熱點。

本研究通過使用生物信息技術，構建“中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡，篩選得到半枝蓮治療MPE的主要活性成分有18種，其中黃芩黃酮、3-甲基鼠李素、薺苧黃酮、黃芩素、木犀草素具有較高的度值和相關性。已有研究表明黃芩黃酮在多種腫瘤中具有抗腫瘤活性作用，黃芩黃酮可作用于特定的腫瘤細胞誘導自噬相關死亡[12]；3-甲基鼠李素具有有效的抗炎、抗氧化特性，可通過miR-34a/Notch-1信號通路誘導人乳腺癌細胞凋亡[13]；薺苧黃酮可緩解機體氧化應激，調節(jié)凋亡相關蛋白，改善機體能量代謝[14]；黃芩素可抑制SW480細胞增殖，誘導細胞皺縮并發(fā)生凋亡[15]；木犀草素與腫瘤發(fā)生、細胞發(fā)育、死亡密切相關[16]。在分子對接結果中，EGFR、AKT1、HIF1A、SRC等靶點具有較高的結合力。AKT1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中高度同源亞型的一種，EGFR是表皮生長因子家族的第一位成員[17]；AKT1和EGFR都具有廣泛的生物學效應，參與調節(jié)腫瘤細胞增殖、分裂、凋亡等多個過程[18]。Yapeng等[19]對80例晚期肺腺癌MPE患者使用表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（epidermal?growth?factor?receptor?tyrosine?kinase?inhibitor，EGFR-TKI）聯(lián)合內皮抑素治療效果顯著高于對照組。AKT1、EGFR靶點可聯(lián)合作用于抑制細胞凋亡過程、參與細胞存活途徑來治療MPE。

SRC是非受體酪氨酸激酶，同樣具有調控癌基因的作用[20]。Ahandoust等[21]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)細胞內和細胞外結構域的膜突蛋白（moesins，MSN）在促癌信號中呈相反作用，過表達MSN可增加SRC的活性。這表明可通過調控MSN來影響SRC通路進而治療MPE。HIF1A可作為轉錄基因調節(jié)多種基因的轉錄，其下游的靶基因參與血管新生、糖酵解等多種細胞功能，MPE中HIF1A相關的診斷及潛在的治療靶點有待進一步挖掘[22-23]。Quanlei等[24]在64個個體生物芯片研究中發(fā)現(xiàn)miR-195-5p、miR-182-5p對良MPE具有明顯的鑒別診斷作用，而HIF1A的mRNA和蛋白質的表達下調。因此miR-195-5p、miR-182-5p可能是通過干預HIF1A參與MPE的病理過程。

通過GO分析發(fā)現(xiàn)半枝蓮作用于MPE主要的生物過程涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、蛋白質自磷酸化等。KEGG通路富集分析結果顯示半枝蓮治療MPE的重要信號通路包括癌癥相關通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路等。Li等[25]發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者接受一線化療或靶向治療后，胸腔積液中EGFR突變率高達88.5%，EGFR基因突變的患者較無突變患者EGFR-TKI治療療效好，EGFR基因是否突變可作為TKI治療的重要預測因子[26-27]。EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路對于指導臨床選擇EGFR-TKI治療MPE具有重要意義。分子對接結果顯示半枝蓮藥物活性成分小分子均與作用靶點完成較好對接，進一步驗證了半枝蓮可有效作用于MPE的猜想。

目前關于半枝蓮治療MPE的研究更多是復方研究，但在MPE的臨床治療中半枝蓮單藥應用廣泛。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘和生物信息技術分析發(fā)現(xiàn)半枝蓮可通過多組分、多靶點、多途徑治療MPE，為后續(xù)MPE的相關研究及臨床防治奠定基礎。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

• 徐碩，?徐文峰，?鄺詠梅，?等.?中藥半枝蓮質量評價的研究進展[J].?西北藥學雜志，?2023，?38（1）：?222–226.?
• 杜義龍，?李賽，?李艷榮，?等.?半枝蓮標準湯劑的指紋圖譜建立與抗氧化活性成分的化學模式識別[J].?2022，?33（4）：?425–432.?
• YANG?L，?WANG?Y.?Malignant?pleural?effusion?diagnosis?and?therapy[J].?Open?Life?Sci，?2023，?18（1）：?20220575.?
• 王景民，?馬曼曼，?高孟秋.?結核感染T細胞斑點試驗在鑒別結核性與惡性胸腔積液中的價值研究[J].?陜西醫(yī)學雜志，?2021，?50（9）：?1147–1149，?1153.?
• 劉曉菊，?趙晉，?劉衛(wèi)，?等.?惡性胸腔積液患者全身及病灶局部氧化抗氧化狀態(tài)的研究[J].?蘭州大學學報（醫(yī)學版），?2008（1）：?5–9.?
• TANDON?R，?MISHRA?J?K，?MANISH?S，?et?al.?Lipid?peroxidation?products?and?nitric?oxide?in?the?evaluation?of?benign?and?malignant?pleural?effusion[J].?J?Physio?Biochem，?2021，?2（8）：?138–144.?
• 杜義龍，?李賽，?李艷榮，?等.?半枝蓮標準湯劑的指紋圖譜建立與抗氧化活性成分的化學模式識別[J].?中國藥房，?2022，?33（4）：?425–432.?
• 金志超.?基于自噬調控腫瘤相關巨噬細胞表型極化探討消水方治療惡性胸腔積液的作用機制[D].?北京：?中國中醫(yī)科學院，?2018.?
• 汪欣文，?姚龑茹，?董新剛，?等.?李佩文合用半邊蓮、半枝蓮治療癌性胸腹水經驗舉隅[J].?山西中醫(yī)，?2018，?34（4）：?6–8.?
• 張潔.?沈敏鶴教授論腫瘤病飲證治驗擷菁[J].?中國實用醫(yī)藥，?2008，?3（33）：?180–181.?
• 駱學新，?洪國標，?童海江.?加味小陷胸湯聯(lián)合順鉑胸腔內化療治療惡性胸腔積液的療效及對相關因子的影響[J].?浙江中醫(yī)雜志，?2019，?54（4）：?242–243.?
• TULI?H?S，?BHUSHAN?S，?KUMAR?A，?et?al.?Autophagy?induction?by?scutellaria?flavones?in?cancer：?Recent?advances[J].?Pharmaceuticals，?2023，?16（2）：?302.?
• LAN?L，?WANG?Y，?PAN?Z，?et?al.?Rhamnetin?induces?apoptosis?in?human?breast?cancer?cells?via?the?miR-34a/?Notch-1?signaling?pathway[J].?Oncol?Lett，?2019，?17（1）：?676–?682.?
• 劉睿，?邵瑾，?趙彤，?等.?薺苧黃酮對低壓低氧小鼠心肌損傷的改善作用與機制研究[J].?中國新藥雜志，?2021，?30（1）：?55–61.?
• 徐佳麗，?路上云，?王佳，?等.?黃芩素通過誘導活性氧產生抑制MET/Akt信號通路促進人結腸癌SW480細胞凋亡[J].?中國藥理學與毒理學雜志，?2022，?36（11）：?812–818.?
• 陳俠，?來慧麗，?賴滿香，?等.?木犀草素上調miR-384對膠質瘤細胞增殖、侵襲和凋亡的影響[J].?沈陽藥科大學學報，?2023，?40（2）：?185–191.?
• EIDE?I，?NILSSEN?Y，?STENALAND?E，?et?al.?Real-?world?data?on?EGFR?and?ALK?testing?and?TKI?usage?in?norway-a?nation-wide?population?study[J].?Cancers，?2023，?15（5）：?1505.?
• ZHANG?P，?SUN?Y，?SHI?Y，?et?al.?Effect?of?isorhamnetin?on?carbonic?anbydrase?ⅠX?expression?and?tumorigenesis?of?bladder?cancer?by?activating?PPAPγ/PTEN/AKT?pathway[J].?Tissue?Cell，?2023，?82（6）：?102048.?
• YAPENG?G，?YANG?L，?LILI?P，?et?al.?Efficacy?of?endostatin?combined?with?EGFR-TKIs?in?the?treatment?of?malignant?pleural?effusion?in?EGFR-positive?advanced?lung?adenocarcinoma[J].?JCMP，?2022，?4（11）：?9.?
• 張鶴，?趙曉宇，?鄭銳，?等.?Src酪氨酸激酶抑制劑對表皮生長因子誘導的肺腺癌細胞生長的作用及機制[J].?中國醫(yī)科大學學報，?2023，?52（2）：?132–136.?
• AHANDOUST?S，?LI?K，?SUN?X，?et?al.?Intracellular?and?extracellular?moesins?differentially?regulate?Src?activity?and?β-catenin?translocation?to?the?nucleus?in?breast?cancer?cells[J].?Biochem?Biophys?Res?Commun，?2023，?639：?62–69.?
• 王平，?閉水清，?劉暢，?等.?人膠質瘤中HIF1A和MAGED4的表達及調控關系初探[J].?中國臨床新醫(yī)學，?2022，?15（10）：?945–950.?
• ZHAO?Y，?YANG?Z，?MA?L，?et?al.?HIF1A?overexpression?predicts?the?high?lymph?node?metastasis?risk?and?indicate?a?poor?prognosis?in?papillary?thyroid?cancer[J].?Heliyon，?2023，?9（3）：?e14714.?
• QUANLEI?B，?YAPING?X，?MING?D，?et?al.?Identification?of?differentially?expressed?miRNAs?in?differentiating?benign?from?malignant?pleural?effusion[J].?Hereditas，?2020，?157（1）：?6.?
• LI?H，?YAN?S，?LIU?X，?et?al.?Disparities?of?EGFR?mutations?between?biopsy?and?rebiopsy?in?non-small?cell?lung?cancer?patients[J].?Zhongguo?Fei?Ai?Za?Zhi，?2018，?21（11）：?821–827.?
• 丁麗，?張萍，?武曉楠，?等.?非小細胞肺癌患者胸腔積液腫瘤細胞EGFR基因突變檢測及其在治療中的價值[J].?河北醫(yī)科大學學報，?2011，?32（1）：?1–4.?
• 魯濤，?李強，?李嵐，?等.?132例晚期非小細胞肺癌胸腔積液EGFR基因突變檢測結果及其臨床意義：?一項來自單中心的回顧性研究[J].?中國肺癌雜志，?2020，?23（12）：?1059–1065.?

（收稿日期：2023–04–26）

（修回日期：2024–01–31）