張怡君,田俊波,楊志彬,郝晉博,胡江林,呂志堂

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071002 2.河北維達(dá)康生物科技有限公司 技術(shù)研發(fā)中心,河北 保定 072152;3.保定保利瑞合生物科技有限公司 技術(shù)研發(fā)中心,河北 保定 072152)

5-羥基-L-色氨酸(5-hydroxy-L-tryptophan, 5-HTP)是神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)的直接生物合成前體,并繼而作為褪黑素(melatonin)合成的前體物質(zhì),5-HTP及其衍生物已被證明對抑郁癥、失眠、慢性頭痛和肥胖等多種疾病的治療有效[1-3],并可以減少癲癇發(fā)作引起的呼吸驟停[4],具有調(diào)節(jié)腸道免疫功能[5]、提高免疫力和細(xì)胞抗氧化能力以及預(yù)防和治療癌癥等保健功能[6-7].長期以來,5-HTP依賴以非洲加納籽(Griffoniasimplifolia)為原料通過植物提取法生產(chǎn)[8].近年來,由于生物技術(shù)特別是合成生物學(xué)的飛速發(fā)展,微生物發(fā)酵合成5-HTP的技術(shù)也取得了極大的進(jìn)步,并率先由保定保利瑞合生物科技有限公司實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[9-11].該方法具有原料成本低、來源廣泛、產(chǎn)品純度高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn),易于工業(yè)化生產(chǎn),已經(jīng)占居超過70%全球市場份額.但是,微生物發(fā)酵液中往往存在著大量的菌體、雜蛋白和膠體顆粒等物質(zhì),這些物質(zhì)的存在使產(chǎn)物收率和結(jié)晶質(zhì)量下降,必須在結(jié)晶前將其去除.現(xiàn)有技術(shù)工藝是先將發(fā)酵液進(jìn)行絮凝和壓濾去除菌體,然后通過離子交換后再進(jìn)行活性炭脫色,進(jìn)而通過蒸發(fā)、結(jié)晶獲得產(chǎn)品.在此過程中由于離子交換法使用大量的堿液進(jìn)行洗脫,致使廢水中有大量鹽的產(chǎn)生,處理不當(dāng)易造成嚴(yán)重的環(huán)境污染.因此,亟需研究開發(fā)出一條從發(fā)酵液中提取純化5-HTP的環(huán)保工藝,應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)中.

膜分離技術(shù)因其無相變、高效率、低能耗和無二次污染等特點(diǎn),已得到廣泛應(yīng)用,在發(fā)酵產(chǎn)物分離提取中既可以用于菌液分離,又可以去除蛋白質(zhì),兼具分離、濃縮、精制等作用[12-14].由于5-HTP發(fā)酵液中主要含有菌體發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖和蛋白質(zhì)及培養(yǎng)基中未利用的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),選擇合適的超濾膜可以選擇性將其去除而保留小分子的5-HTP.近年來,無機(jī)陶瓷超濾膜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于有機(jī)酸、氨基酸、醇類和抗生素等發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)[14-18],與傳統(tǒng)過濾分離技術(shù)相比,無機(jī)陶瓷超濾膜具有化學(xué)穩(wěn)定性佳、耐強(qiáng)酸堿、耐有機(jī)溶劑、抗污染性好、機(jī)械強(qiáng)度高、孔徑分布窄、分離精度高和膜易清洗等特點(diǎn),正在逐漸取代傳統(tǒng)的聚醚砜(polyethersulfone, PES)超濾膜[15-17].本文選擇陶瓷超濾膜應(yīng)用于從發(fā)酵液中提取5-HTP的工藝,篩選出孔徑最適合的陶瓷超濾膜,對此膜的過濾條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),優(yōu)化出最佳工藝條件,為陶瓷超濾膜應(yīng)用于5-HTP的工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用發(fā)酵液(保定保利瑞合生物科技有限公司),系大腸桿菌(Escherichiacoli)工程菌GHTP以葡萄糖為原料發(fā)酵得到.

錯(cuò)流膜過濾系統(tǒng)(CLMB-6-2S型,紹興海納膜技術(shù)有限公司),采用 4、10、20 nm ZrO219通道內(nèi)壓管式陶瓷超濾膜(合肥世杰膜工程有限責(zé)任公司),管膜外徑30 mm,通道內(nèi)徑4 mm,管長1 016 mm,膜面積 0.24 m2;高效液相色譜儀(Agilent LC1200,美國安捷倫公司),可變波長紫外檢測器(G1314B/C);超純水系統(tǒng) (Milli-Q,美國密理博);電子分析天平(Sartorius BL4100,德國 Sartorius).

5-HTP對照品(Sigma 公司);甲醇(色譜純);其他試劑均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)條件

為建立適合發(fā)酵液中5-HTP分離提取的陶瓷超濾膜工藝,對4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),分別為陶瓷超濾膜孔徑(4、10、20 nm),發(fā)酵液預(yù)調(diào)pH 值(3.0、3.5、4.0),過膜料液溫度(25、35、45 ℃), 跨膜壓差(0.5、0.75、1.0 MPa).綜合考慮放大生產(chǎn)后公司實(shí)際產(chǎn)能及發(fā)酵提取周期需求,以連續(xù)3 h膜通量(permeate flux,F)、5-HTP透過率(permeate ratio,P)和對游離蛋白質(zhì)截留率(rejection ratio,R) 的平均值為考察指標(biāo),確定各因素的最優(yōu)條件.

各考察指標(biāo)計(jì)算公式為

1)膜通量

F=V/(S·t),

其中:V為陶瓷超濾膜透過液體積(L),t為收集陶瓷超濾膜透過液所需時(shí)間(min),S為陶瓷超濾膜膜面積(m2).

2)5-HTP透過率

P=(c1×V1)/(c2×V2)×100%,

其中:c1為超濾膜透過液 5-HTP濃度,V1為超濾膜透過液體積,c2為發(fā)酵液5-HTP濃度,V2為發(fā)酵液體積.

3)對游離蛋白質(zhì)截留率

R= (V2×c3-V1×c4)/(V2×c3)×100%,

其中:c3為發(fā)酵液中游離的蛋白質(zhì)含量,c4為超濾膜透過液中游離的蛋白質(zhì)含量.

1.2.2 檢測方法

取經(jīng)滅活處理后的5-HTP發(fā)酵液并調(diào)節(jié)pH值,通過循環(huán)泵進(jìn)入錯(cuò)流膜過濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾,得到超濾清液;HPLC檢測5-HTP和色氨酸的含量(圖1).檢測條件:色譜柱為Hypersil ODS C18 250 mm×4.6 mm ID,5 μm(Thermo Fisher);檢測器為UV檢測器;流動相為體積比92∶8的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0% (pH 3.00±0.04) 磷酸二氫鉀與甲醇混合液;流速為1.0 mL/min;檢測波長為275 nm;進(jìn)樣量為10 μL;柱溫箱溫度為35 ℃;運(yùn)行時(shí)間為20 min.

圖1 5-HTP和色氨酸對照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of reference substarce 5-HTP and tryptophan

采用Bradford 法[19]以標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(百克賽斯生物科技有限公司)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定游離蛋白質(zhì)含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾膜最優(yōu)孔徑的優(yōu)選

根據(jù)不同孔徑超濾膜與截留分子質(zhì)量(molecular weight cut-off, MWCO)對應(yīng)關(guān)系[20],要想使分子直徑5 nm的蛋白質(zhì)截留率大于90%,超濾膜最大孔徑約為10 nm;另根據(jù)蛋白質(zhì)分子半徑(stokes-einstein radius)與分子質(zhì)量關(guān)系r=8.8M1/3nm[21],分子質(zhì)量10 ku的蛋白質(zhì)的分子直徑約4 nm,而本研究底盤細(xì)胞大腸桿菌蛋白質(zhì)分子質(zhì)量多數(shù)大于10 ku[22].考慮到調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值后蛋白質(zhì)可能出現(xiàn)的變性聚集等效應(yīng),本研究選擇4、10、20 nm 3種孔徑的陶瓷超濾膜,將發(fā)酵液調(diào)為pH3.5、進(jìn)膜壓力設(shè)為0.75 MPa,進(jìn)料溫度設(shè)為35 ℃的條件下進(jìn)行超濾,考察3種膜的膜通量(F)、5-HTP透過率(P)和對游離蛋白質(zhì)截留率(R),結(jié)果見圖2.

a、b、c表示不同處理在0.01水平顯著差異A.陶瓷膜孔徑對F的影響;B.陶瓷膜孔徑對P的影響;C.陶瓷膜孔徑對R的影響

從圖2可看出,4、10、20 nm孔徑濾膜的膜通量分別為65.21、86.28、89.62 L/(m2·h),對5-HTP的透過率分別為62.21%、92.25%和95.69%,超濾膜的孔徑對過濾時(shí)的膜通量、5-HTP的透過率有極顯著影響(P<0.01),孔徑大的膜通量和5-HTP透過率也更大,但對游離蛋白質(zhì)截留率隨濾膜孔徑增大而顯著降低(P<0.01),4、10、20 nm孔徑濾膜對游離蛋白的截留率分別為96.51%、90.25%和74.62%.20 nm孔徑濾膜對游離蛋白截留率達(dá)不到后續(xù)5-HTP結(jié)晶要求,而4 nm孔徑濾膜的膜通量太低,超濾處理周期長、能耗高.綜合膜通量、5-HTP透過率和對游離蛋白質(zhì)截留率3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行考察,故選擇超濾膜的孔徑為10 nm 更為合適.

2.2 發(fā)酵液pH值對膜分離效果的影響

pH會影響到發(fā)酵液中5-HTP和蛋白質(zhì)的溶解性.由于5-HTP在酸性條件下穩(wěn)定,且在生產(chǎn)中酸性條件下不容易污染雜菌[23],而堿性條件下5-HTP易氧化變質(zhì),不利于產(chǎn)品質(zhì)量控制,故只考察酸性條件下對5-HTP膜分離效果的影響.超濾前分別將發(fā)酵液調(diào)至pH 3.0、3.5、4.0,在陶瓷超濾膜孔徑10 nm、跨膜壓差0.75 MPa和過膜料液溫度35 ℃的條件下進(jìn)行超濾,考察膜的膜通量、超濾后 5-HTP透過率和對游離蛋白質(zhì)截留率,結(jié)果見圖3.

a、b、c表示不同處理在0.01水平顯著差異A.發(fā)酵液pH值對F的影響;B.發(fā)酵液pH值對P的影響;C.發(fā)酵液pH值對R的影響

由圖3可看出,發(fā)酵液調(diào)不同pH值時(shí)對膜的通量、5-HTP的透過率和對游離蛋白質(zhì)截留率影響極大(P<0.01).實(shí)驗(yàn)條件下(pH 3.0～4.0),隨發(fā)酵液預(yù)調(diào)pH值升高陶瓷膜的通量增大,但對游離蛋白質(zhì)截留率的影響則隨pH升高而降低.孔徑10 nm的陶瓷膜對5-HTP的透過率在pH3.5時(shí)(92.35%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pH3.0(63.21%)和pH4.0時(shí)(84.12%)(P<0.01),雖然pH3.5時(shí)膜通量較pH4.0時(shí)低(86.58% vs. 88.79%),對蛋白質(zhì)截留率也較pH3.0時(shí)低(90.36% vs. 90.89%),但2項(xiàng)指標(biāo)也均達(dá)到了一般膜分離時(shí)技術(shù)指標(biāo)要求,為盡可能保證5-HTP提取收率,綜合膜通量、5-HTP透過率和對游離蛋白質(zhì)截留率3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行考察,故選擇調(diào)發(fā)酵液的 pH3.5更為合適.

2.3 跨膜壓差對膜分離效果的影響

綜合考慮本次實(shí)驗(yàn)所用陶瓷超濾膜設(shè)備和管道連續(xù)工作承受最高壓力1.0 MPa,為提高膜通量,選擇0.5、0.75和1.0 MPa 3種跨膜壓差(transmembrane pressure, TMP),在陶瓷超濾膜孔徑10 nm、pH3.5和過膜料液溫度35 ℃的條件下進(jìn)行超濾,考察膜的膜通量、5-HTP透過率和對游離蛋白質(zhì)截留率,結(jié)果見圖4.

a、b、c表示不同處理在0.01水平顯著差異A.跨膜壓差對F的影響;B.跨膜壓差對P的影響;C.跨膜壓差對R的影響

由圖4可知,實(shí)驗(yàn)條件下跨膜壓差對膜通量、5-HTP的透過率和對游離蛋白質(zhì)截留率影響極大(P<0.01).跨膜壓差是超濾膜過濾過程的動力,對膜通量具有重要影響.跨膜壓差過小會使發(fā)酵液的流速慢,在膜表面容易積累,超濾過程中受到傳質(zhì)控制,導(dǎo)致膜通量下降.跨膜壓差過大會使5-HTP(或蛋白質(zhì))等溶質(zhì)被迅速地壓實(shí)在膜面上,在膜表面形成極化層,超濾過程中也受到傳質(zhì)控制,從而導(dǎo)致膜通量下降.無論使用PES超濾膜還是陶瓷超濾膜,大多數(shù)文獻(xiàn)中都采用了較低(0.5 MPa以下)的跨膜壓差進(jìn)行超濾分離[14-16],而本研究發(fā)現(xiàn)在較高的跨膜壓差0.75 MPa時(shí)不僅可以極大地提高膜通量(0.75 MPa時(shí)86.38 L/(m2·h) vs. 0.5 MPa時(shí)65.99 L/(m2·h)),而且可以極大地提高5-HTP的通過率(0.75 MPa時(shí)92.15% vs. 0.5 MPa時(shí)63.21%),但對可溶蛋白質(zhì)截留率(90.45%)依然滿足工藝要求,因此為使錯(cuò)流膜過濾系統(tǒng)在較高的通量下運(yùn)行,綜合膜通量、5-HTP的透過率和對游離蛋白質(zhì)截留率 3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行考察,選擇發(fā)酵液過膜壓力0.75 MPa更為合適.

2.4 料液過膜溫度對膜分離效果的影響

借鑒傳統(tǒng)PES超濾膜的經(jīng)驗(yàn)[22]及保定保利瑞合生物科技有限公司以往生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn),選擇3種溫度(25、35、45 ℃)的發(fā)酵液,在陶瓷超濾膜孔徑10 nm、跨膜壓差0.75 MPa和pH3.5 的條件下進(jìn)行超濾,考察膜的膜通量、5-HTP透過率和對游離蛋白質(zhì)截留率,結(jié)果見圖5.

a、b、c表示不同處理在0.01水平顯著差異A.料液過膜溫度對F的影響;B.料液過膜溫度對P的影響;C.料液過膜溫度對R的影響

傳統(tǒng)PES超濾膜通量隨溫度的增加而增加,但當(dāng)溫度達(dá)到 35 ℃以后,膜通量增幅變?nèi)鮗24],因此料液過膜溫度選用35 ℃.雖然45 ℃時(shí)陶瓷超濾膜通量較35 ℃時(shí)要高(88.79 L/(m2·h) vs. 85.98 L/(m2·h),P<0.01),但45 ℃時(shí)5-HTP透過率(81.14% vs. 92.38%)及對可溶蛋白質(zhì)截留率(73.27% vs. 89.25%)下降更為顯著.綜合膜通量、5-HTP的透過率和對游離蛋白質(zhì)截留率3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行考察,故選擇發(fā)酵液過膜溫度35 ℃更為合適.

3 討論與結(jié)論

綜上所述,本研究建立了適于從發(fā)酵液中工業(yè)化提取5-HTP的陶瓷膜超濾分離工藝條件,將大腸桿菌工程菌GHTP發(fā)酵液酸化調(diào) pH 值3.5,采用10 nm孔徑的陶瓷超濾膜,跨膜壓差0.75 MPa、料液過膜溫度35 ℃條件下5-HTP的透過率在92%以上,對游離蛋白質(zhì)截留率達(dá) 90%以上,完全滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求,且較傳統(tǒng)工藝更加節(jié)能、環(huán)保.