成樹貞 陳恒 任偉宏

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)教研中心，河南 鄭州 450000）

原發(fā)性肝癌（Primary liver carcinoma，PLC）是國內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤侵襲性強(qiáng)，患者生存率低[1]。多數(shù)肝癌患者就診時(shí)已為中晚期，導(dǎo)致其預(yù)后不佳。在所有原發(fā)性肝癌病例中，其中70-90%是肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。目前化療和免疫療法是治療肝細(xì)胞癌的最佳選擇[2]。泛素結(jié)合酶2A（Ubiquitin binding enzyme 2A，UBE2A）是一組E2 酶的成員，這些酶通過催化不同靶蛋白的泛素化參與DNA 的損傷修復(fù)[3]。

既往研究表明，UBE2A 被認(rèn)為是指導(dǎo)不同DNA損傷修復(fù)途徑的節(jié)點(diǎn)，并且UBE2A 在某些癌細(xì)胞系和腫瘤中過度表達(dá)[4]。與正常卵巢組織相比，UBE2A在卵巢癌（Ovarian cancer，OC）中表達(dá)上調(diào)，并且UBE2A 的高表達(dá)與OC 患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[5]。但目前UBE2A 在HCC 中的作用和功能仍然未知。

因此，本研究擬通過挖掘公共數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的肝細(xì)胞癌的數(shù)據(jù)信息，分析UBE2A 在肝細(xì)胞癌中的差異性表達(dá)和相關(guān)調(diào)控因子，以及其與臨床預(yù)后和免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系，UBE2A 將可能成為診療肝細(xì)胞癌患者新的分子靶點(diǎn)，為HCC 的早期診斷、預(yù)后和治療方面提供依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 UBE2A 在不同腫瘤中的表達(dá)

使用Timer2.0 數(shù)據(jù)庫（http://timer.cistrome.org/）研究UBE2A 在所有TCGA 腫瘤中的表達(dá)情況，分析UBE2A 在各種腫瘤和相鄰正常組織間的表達(dá)差異。

1.2 UBE2A 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及預(yù)后

GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）包含了9736 個(gè)腫瘤和8587 個(gè)正常TCGA 和GTEX樣本的RNA 測序表達(dá)數(shù)據(jù)。我們使用GEPIA 工具進(jìn)一步分析驗(yàn)證UBE2A 在肝細(xì)胞癌組織和正常組織中的表達(dá)差異情況，并分析患者的生存預(yù)后。

1.3 調(diào)控因子的篩選及與UBE2A 調(diào)控關(guān)系預(yù)測

GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，合并使用關(guān)鍵詞：Hepatocellular carcinoma 和microRNA 檢索數(shù)據(jù)。選出符合要求的表達(dá)譜數(shù)據(jù)（GSE108724），其中包括7 例人肝細(xì)胞癌組織和7例癌旁組織。利用GEO2R 在線工具分析獲得DEmiRNAs 和火山圖。我們使用mirDIP 分析了差異表達(dá)microRNA 和UBE2A 之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并使用Cytoscape 工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.4 UBE2A 與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性的分析

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）中的TCGA 數(shù)據(jù)，分析UBE2A 基因在不同性別、年齡、轉(zhuǎn)移、分期及病理亞型中的表達(dá)。

1.5 UBE2A 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

使用Timer（http://cistrome.shinyapps.io/timer/）工具分析肝細(xì)胞癌中UBE2A 的表達(dá)與B 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞浸潤的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與作圖。腫瘤組織與正常組織中UBE2A 的表達(dá)差異使用非配對t 檢驗(yàn)，組間比較采用t 檢驗(yàn)（方差齊）或Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)（方差不齊）；Kaplan-Meier 曲線評估UBE2A 基因改變與肝細(xì)胞癌患者生存情況之間的相關(guān)性。UBE2A 表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，UBE2A 表達(dá)與免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同腫瘤組織中UBE2A 基因表達(dá)水平

在Timer2.0 數(shù)據(jù)庫中分析顯示，UBE2A 基因表達(dá)水平在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、宮頸癌、膽管癌、結(jié)腸腺癌、食管癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃腺癌等腫瘤中，與對應(yīng)正常組織相比明顯高表達(dá)（P＜0.05，圖1）。特別是在肝細(xì)胞癌中，UBE2A 在癌組織中的表達(dá)也顯著高于正常組織（P＜0.001，圖1）。

圖1 Timer2.0 數(shù)據(jù)庫中UBE2A 基因表達(dá)水平

2.2 UBE2A 在肝細(xì)胞癌及正常組織中的mRNA 表達(dá)水平

GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析肝細(xì)胞癌與正常組織UBE2A mRNA 的表達(dá)差異，結(jié)果如圖2A 所示，UBE2A 在肝細(xì)胞癌中顯著高表達(dá)（P＜0.05）。進(jìn)一步分析UBE2A 高低表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系，繪制總體生存曲線，結(jié)果顯示UBE2A 高表達(dá)患者預(yù)后較差（P=0.045），見圖2B。

圖2 UBE2A 基因在肝細(xì)胞癌及正常組織間的表達(dá)差異及總生存曲線

2.3 差異表達(dá)microRNA 篩選及與UBE2A 調(diào)控關(guān)系預(yù)測

本研究進(jìn)一步收集并分析了肝細(xì)胞癌microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)（GSE108724）。GSE108966 包含3 個(gè)上調(diào)和4 個(gè)下調(diào)差異表達(dá) microRNA（圖3A）。以P ＜0.05 且|logFC|＞1 為篩選條件得到6 個(gè)顯著差異表達(dá)microRNA，包括hsa-miR-375、hsa-miR-4270、hsamiR-93-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-3188、hsa-miR-3651。mirDIP 分析 6 個(gè)差異 microRNA 與UBE2A調(diào)控關(guān)系顯示，3 個(gè)microRNA（hsa-miR-375、hsamiR-93-5p、hsa-miR-106b-5p）與UBE2A 有潛在調(diào)控 關(guān)系，見圖3B。

圖3 肝細(xì)胞癌樣本差異表達(dá) microRNA 火山圖及靶基因調(diào)控圖

2.4 UBE2A 與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)分析

UALCAN 數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明，UBE2A 基因在肝細(xì)胞癌組織中較正常組織明顯高表達(dá)（P＜0.001，圖4A），其表達(dá)與性別、年齡、淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05圖4B，4C，4D）。

圖4 肝細(xì)胞癌中UBE2A 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

腫瘤一期患者UBE2A 基因的表達(dá)水平與二期和三分期相比，三期與四期相比具有顯著性差異（P ＜0.05，圖4E）。UBE2A 在肝細(xì)胞癌和纖維板層癌中有更高的表達(dá)（P ＜ 0.05，圖4F）。

2.5 UBE2A 與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

Timer 軟件分析顯示，UBE2A 與B 細(xì)胞（P ＜0.001，r=0.32）、CD8+T 細(xì)胞（P ＜ 0.001，r=0.214）、CD4+T 細(xì)胞（P ＜ 0.001，r=0.354）、巨噬細(xì)胞（P ＜ 0.001，r=0.383）、中性粒細(xì)胞（P ＜0.001，r=0.406）和樹突狀細(xì)胞（P ＜ 0.001，r=0.378）的浸潤水平呈正相關(guān)，見圖5。

圖5 肝細(xì)胞癌中UBE2A 與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

3 討論

人類泛素結(jié)合酶E2A 編碼E2 泛素結(jié)合酶家族的一個(gè)成員[6]。泛素蛋白充當(dāng)信號信使，控制細(xì)胞周期進(jìn)程，包括后DNA 轉(zhuǎn)錄修飾、凋亡和細(xì)胞增殖[7]。泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑是癌癥治療的新藥物靶點(diǎn)之一[8]。蛋白UBE2A 在泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑中起重要作用[9]。然而，其在腫瘤中的作用機(jī)制越來越受到重視，UBE2A 可作為原癌基因，并且被視為癌癥的治療新靶點(diǎn)。目前，UBE2A 在肝細(xì)胞癌中的研究尚未見報(bào)道。

有研究報(bào)道，UBE2A 在幾種類型的癌癥中出現(xiàn)高表達(dá)，且UBE2A 陽性者惡性腫瘤發(fā)生率明顯高于UBE2A 陰性者[10]。例如UBE2A 在淋巴瘤[11]、鼻咽癌[12]、白血病[13]等疾病中異常表達(dá)。我們的研究結(jié)果也顯示，肝細(xì)胞癌組織中UBE2A 基因過表達(dá)。本研究中，通過Timer2.0 數(shù)據(jù)庫分析顯示UBE2A 在包括膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、宮頸癌、膽管癌、結(jié)腸腺癌、食管癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤中，與其對應(yīng)的正常組織相比表達(dá)均上調(diào)。為進(jìn)一步分析UBE2A 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析UBE2A 在肝細(xì)胞癌中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示UBE2AmRNA 在肝細(xì)胞癌中過表達(dá)，并且其高表達(dá)患者預(yù)后較差。本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-375 在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，hsa-miR-93-5p 和hsa-miR-106b-5p 在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，使用mirDIP 工具預(yù)測出上述三個(gè)microRNA 參與UBE2A的調(diào)控，然而目前其在肝細(xì)胞癌中的功能和作用尚未見相關(guān)研究報(bào)道。

UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析表明，UBE2A 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平與患者性別、年齡、淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)，但與患者腫瘤分期有關(guān)，腫瘤一期患者UBE2A 基因的表達(dá)與二期和三期相比，三期與四期患者相比，具有顯著性差異。因此本研究還需要進(jìn)一步進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)UBE2A 的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的相關(guān)性。利用Timer 數(shù)據(jù)庫分析顯示UBE2A與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)。UBE2A 高表達(dá)患者腫瘤免疫細(xì)胞增多可能影響其惡性生物學(xué)行為。腫瘤浸潤免疫細(xì)胞受宿主免疫狀態(tài)的影響，并能被藥物有效靶向，這與免疫治療的臨床療效相一致。以上結(jié)果均提示UBE2A 可作為判斷肝細(xì)胞癌預(yù)后和治療的重要指標(biāo)。

4 結(jié)論

UBE2A 有望成為肝細(xì)胞癌診斷的新型標(biāo)志物和治療的潛在分子靶點(diǎn)。