王志剛 董青川 孫羿 段萬里 管振鋒 潘亮

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2017年1月～2017年5月,我院泌尿外科招募了12例BUC病人(器官局限性和非器官局限性疾病各6例)和4例非癌志愿者,作為發(fā)現(xiàn)適合生物標(biāo)志物的miRNA的發(fā)現(xiàn)集。2017年1月～2022年3月,進(jìn)一步從我院泌尿外科招募BUC病人作為驗(yàn)證集。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)首次診治;(2)由兩名病理學(xué)家根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)癌癥分期手冊(cè)第8版對(duì)活檢組織進(jìn)行審查[6];(3)接受根治性膀胱切除手術(shù);(4)診斷前未接受過任何抗癌治療。排除任何其他活動(dòng)性惡性腫瘤、接受非根治性手術(shù)或姑息治療的BUC病人或者近3個(gè)月合并其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、活動(dòng)性感染或炎癥者。獲得書面知情同意。共采集了152例BUC病人診斷時(shí)的尿液樣本作為驗(yàn)證集樣本,男性121例,女性31例,年齡37～94歲,平均年齡(68.47±10.22)歲,非器官局限性疾病57例,器官局限性疾病95例。器官局限性疾病為臨床診斷T分期在Tis-T2,且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0);非器官局限性疾病為手術(shù)時(shí)分期≥pT3(pT3～T4N0M0)或病理性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(pTxN+M0)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性疾病(TxNxM1)[3,7-8]。從我院體檢中心選擇了126例非癌對(duì)照,男性111例,女性15例,年齡37～94歲,平均年齡(67.37±12.03)歲,年齡和性別與BUC病人相匹配(P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

1.尿外泌體提純及鑒定: 收集的尿液樣品以高速和超高速離心分離外泌體。用JEOL 1011 CX-T透射電子顯微鏡(TEM)、NanoSight NS300納米顆粒追蹤分析儀(NTA)和蛋白免疫印跡[兔抗CD9,兔抗鈣連蛋白(Calnexin),兔抗腫瘤易感基因101(TSG101),英國Abcam]進(jìn)行外泌體表征分析。

2.發(fā)現(xiàn)集尿樣外泌體miRNA高通量測序及分析:使用Illumina的NEB Next Multiplex Small RNA Library Prep Set生成測序文庫。將適配器連接的RNA與ProtoScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、第一鏈合成反應(yīng)緩沖液混合,50 ℃孵育60分鐘。在Illumina Hiseq X ten平臺(tái)上對(duì)文庫進(jìn)行測序。

3.尿外泌體miR-29c水平驗(yàn)證 使用Trizol試劑分離外泌體總mRNA。PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒對(duì)miRNA逆轉(zhuǎn)錄合成后,使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)。用2-ΔΔCT法將miR-29c標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照cel-miR-39或內(nèi)源性對(duì)照U6 snRNA中的峰值。

4.隨訪:包括體格檢查、尿液細(xì)胞學(xué)檢查、血液分析、胸腹部計(jì)算機(jī)斷層掃描和膀胱鏡檢查。腫瘤復(fù)發(fā):放射影像學(xué)檢查中局部區(qū)域復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。無病生存(DFS)期從手術(shù)日期計(jì)算到腫瘤復(fù)發(fā)或最后一次隨訪?？偵?OS)期依據(jù)手術(shù)日期到死亡日期確定,或在最后一次隨訪日期進(jìn)行審查。疾病特異性生存(DSS)期從手術(shù)之日起計(jì)算至疾病死亡或最后一次隨訪。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0軟件處理數(shù)據(jù),二分類變量以率(頻率)表示和χ2檢驗(yàn)。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位值[IQR])表示和Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估尿外泌體miR-29c對(duì)于BUC的臨床診斷。用Kaplan-Meier生存曲線分析尿外泌體miR-29c與BUC病人臨床結(jié)局的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.尿外泌體鑒定 :尿外泌體表征為直徑50～200 nm橢圓形或碗狀的雙層膜囊泡,沒有細(xì)胞核(圖1A,B),其存在外泌體特征蛋白CD9和TSG101;相反,外泌體陰性標(biāo)記Calnexin表達(dá)缺失(圖1C)。

A示TEM圖像;B示蛋白免疫印跡檢測;C示NTA結(jié)果表明,從尿液中富集的外泌體約為50～200 nm

2.高通量測序分析尿外泌體miRNA表達(dá)譜: 在發(fā)現(xiàn)集樣本中,與非癌對(duì)照組相比,在BUC病人的尿液外泌體中發(fā)現(xiàn)17個(gè)miRNA上調(diào),22個(gè)miRNA下調(diào)。熱圖顯示了尿外泌體miRNA的顯著不同的分布(圖2A)。在TCGA數(shù)據(jù)集中也進(jìn)行了DEMs分析,發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比,BC組織中有106個(gè)miRNA上調(diào),26個(gè)miRNA下調(diào)。交叉分析和Venn圖顯示,這2種分析之間共有3種DEMs,且都是上調(diào)(圖2B),包括miR-29c、miR-17-5p、miR-590-5p。

(A)差異表達(dá)尿外泌體衍生生miRNA的熱圖(BUC vs.非癌對(duì)照);(B)Venn圖顯示了TCGA數(shù)據(jù)庫的差異miRNA表達(dá)譜和高通量測序技術(shù)之間的下調(diào)miRNA

3.尿外泌體miRNAs結(jié)果驗(yàn)證: 在驗(yàn)證集中,152份尿外泌體中miR-29c水平低于非癌對(duì)照組[0.30(0.17,0.46) VS 1.04(0.74,1.37),Z=-13.475,P<0.001]。然而,在BUC和非癌對(duì)照組之間,尿外泌體miR-17-5p水平[0.91(0.57,1.80) VS 0.99(0.65,1.72),Z=-0.911,P=0.204]和miR-590-5p水平[1.07(0.70,1.85) VS 1.12(0.65,2.03),Z=-0.894,P=0.317]沒有顯著差異。進(jìn)一步分析,尿外泌體miR-29c用于診斷BUC的AUC值為0.969(95%CI:0.953～0.986)(圖3)。相應(yīng)的敏感性和特異性分別為92.1%和90.2%。與尿細(xì)胞學(xué)(敏感性:25.9%,特異性:100.0%)相比,尿外泌體miR-29c的敏感性更高(P<0.001)。

圖3 尿外泌體miR-29c水平對(duì)BUC的診斷價(jià)值

4.亞型分析 :非器官局限性BUC病人尿外泌體miR-29c水平較器官局限性BUC病人進(jìn)一步降低[0.24(0.08,0.41)vs.0.35(0.23,0.52),Z=-2.517,P=0.009]。

5.Kaplan-Meier生存分析:最短隨訪1.0個(gè)月,最長隨訪78.5個(gè)月,中位隨訪17.75個(gè)月。無論是在器官局限性BUC病人中,還是在非器官局限性BUC病人中,尿外泌體miR-29c高表達(dá)組病人OS期、DFS期和DSS期均更長(P<0.05,表1,圖4和圖5)。

表1 尿外泌體miR-29c水平與BUC病人生存預(yù)后的關(guān)系

圖4 器官局限性病人Kaplan-Meier曲線

圖5 非器官局限性病人Kaplan-Meier曲線

討論

BUC是一種異質(zhì)性疾病,具有多變的自然病史[9]。由于缺乏準(zhǔn)確的分期工具,肌層浸潤性膀胱癌的管理一直受到影響[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),術(shù)前尿外泌體miR-29c低表達(dá)水平與更差的腫瘤學(xué)結(jié)局有關(guān),有希望作為預(yù)測RC后器官和非器官局限性BUC病人的不良臨床結(jié)局的生物標(biāo)志物。尿外泌體miR-29c水平可能有助于促進(jìn)病人圍手術(shù)期化療和切除范圍的臨床決策。

與血液等其他臨床樣本相比,尿液在臨床應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢:非侵入性獲取且易于獲取,miRNA在尿液來源的外泌體中更加豐富和穩(wěn)定[4]。本研究通過高通量測序結(jié)合RT-qPCR檢測,對(duì)BUC病人和非癌對(duì)照的尿外泌體衍生miRNA譜進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,BUC組病人尿外泌體miR-29c水平較非癌對(duì)照組顯著且穩(wěn)定降低。ROC分析表明,尿外泌體miR-29c在BUC診斷中具有較高的AUC值,而且非器官局限性BUC病人尿外泌體miR-29c水平較器官局限性BUC病人進(jìn)一步降低。這些結(jié)果說明,miR-29c低表達(dá)可能預(yù)示著疾病進(jìn)展。在預(yù)后分析中,無論是器官局限性BUC病人還是在非器官局限性BUC病人,尿外泌體miR-29c高表達(dá)組病人OS期、DFS期和DSS期均更長,表明miR-29c是BUC病人預(yù)后的有利因素。

miR-29c為癌癥抑制基因,可以抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其表達(dá)下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[10-13]。miR-29c可通過靶向血管內(nèi)皮生長因子抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。Yu等[13]研究表明,miR-29c通過調(diào)節(jié)靶基因CAPN7的表達(dá)影響UC細(xì)胞的遷移和侵襲。Guo等[14]研究發(fā)現(xiàn),通過抑制miR-29c可上調(diào)TUG1從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這些研究均提示miR-29c水平降低可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡率增加。

總之,本研究結(jié)果提供了尿外泌體miR-29c在BUC診斷以及器官局限性和非器官局限性BUC中重要預(yù)后生物標(biāo)志物的證據(jù)。術(shù)前檢測尿外泌體miR-29c可能有助于改善BUC病人的風(fēng)險(xiǎn)分層,并促進(jìn)臨床決策。尿外泌體miR-29c高水平是BUC病人有利的預(yù)后因子,對(duì)于考慮BUC臨床風(fēng)險(xiǎn)分層有一定指導(dǎo)意義。