胡曉蓮 盛芳玲 黃學(xué)娣 唐莉華

（江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，江西 南昌 330003）

旋覆花為菊科植物旋覆花或歐亞旋覆花干燥的頭狀花序，別名有“金沸草”“六月菊”等，具有降氣化痰、止嘔等功效［1-3］，為2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》收載之品種，臨床常用于治療肋下脹滿(mǎn)、祛濕、下行疏氣?，F(xiàn)今報(bào)道［4-8］，旋覆花含有豐富的倍半萜類(lèi)及內(nèi)酯類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等諸多藥理作用［9-14］，并廣泛運(yùn)用于經(jīng)典復(fù)方和現(xiàn)代中藥制劑中。同時(shí)，關(guān)于旋覆花，有“諸花皆升，唯我獨(dú)降”的說(shuō)法，對(duì)肺部疾病的治療具有特殊的考究意義。至今，對(duì)于旋覆花的功效成分的提取報(bào)道不多［14-16］，而中藥有效成分的提取是決定中藥藥效的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)今常利用現(xiàn)代科學(xué)的統(tǒng)計(jì)思維優(yōu)化中藥的提取工藝，這對(duì)中藥有效成分的溶出和中藥資源合理的利用具有顯著的指導(dǎo)意義。本研究中，采用單因素結(jié)合效應(yīng)面法（Box-Behnken）設(shè)計(jì)優(yōu)化篩選旋覆花的提取工藝，并對(duì)優(yōu)化后制備的提取物進(jìn)行不同干燥方式的考察，以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)依據(jù)，篩選出最優(yōu)干燥方式，以期為未來(lái)開(kāi)發(fā)以旋覆花為主的抗氧化產(chǎn)品提供合理的生產(chǎn)工藝依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器日本島津LC-20AT 高效液相色譜儀系列，JY10002 電子天平［聚儀惠供應(yīng)鏈（青島）有限公司］；電熱恒溫干燥箱（滄州極光試驗(yàn)儀器有限公司）；遠(yuǎn)紅外干燥箱（上海昕?jī)x儀器儀表有限公司）；真空冷凍干燥箱（常州市孝昌干燥設(shè)備有限公司）；KQ250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 材料對(duì)照品麝香草酚（批號(hào)：100508-201603），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（批號(hào)：202109，規(guī)格為250 mg），購(gòu)于武漢卡諾斯科技有限公司；色譜級(jí)甲醇（Fisher 公司），其余試劑分析純。旋覆花5 kg，購(gòu)自江西樟樹(shù)藥材市場(chǎng)，經(jīng)唐莉華鑒定為旋覆花正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備取旋覆花粉末（過(guò)四號(hào)篩）0.5 g，精密稱(chēng)定，置25 mL 容量瓶中，加75%乙醇溶解并稀釋至刻度，稱(chēng)重，超聲30 min，冷卻，稱(chēng)重，以75%乙醇補(bǔ)足失重，濾過(guò)，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備精密稱(chēng)取麝香草酚適量，制備成每1 mL含0.4006 mg的溶液，備用。

2.3 色譜條件月旭C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-水（70∶30）；柱溫30 ℃，流速：1.0 mL/min，波長(zhǎng)275 nm。系統(tǒng)適應(yīng)性高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 旋覆花溶液系統(tǒng)適應(yīng)性高效液相色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系精密吸取對(duì)照品溶液，按不同體積進(jìn)行稀釋?zhuān)苑迕娣e（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程Y＝2015422.1691X-53956.81426，r=0.9994，麝香草酚在4.0006～40006 μg/mL間進(jìn)樣量與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄麝香草酚峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.61%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)同一供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄麝香草酚峰面積，其RSD為0.34%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一樣品，制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，記錄麝香草酚峰面積，麝香草酚的平均含量為0.6589 mg/g，RSD為1.42%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率取供試品粉末，按100%量進(jìn)行加樣，制備樣品，記錄麝香草酚峰面積，麝香草酚的回收率為100.98%，RSD為0.52%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 旋覆花提取工藝單因素考察

2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)［7］的方法，在基礎(chǔ)條件為回流30 min，料液比1∶30，提取1 次的情況下，保持其他因素不變，只改變其中1 個(gè)因素，設(shè)置料液比=1∶10、1∶20、1∶30、1∶40及1∶50；提取時(shí)間15 min、30 min、45 min、60 min 及90 min；提取次數(shù)為1 次、2 次、3 次；以麝香草酚含量和浸膏得率為考察指標(biāo)，對(duì)單因素進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 旋覆花溶液?jiǎn)我蛩乜疾旖Y(jié)果

2.5.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素的結(jié)果，在此基礎(chǔ)上以不同料液比（A，包括1∶15、1∶30、1∶45）、不同提取時(shí)間（B，包括20 min、30 min、40 min）及不同提取次數(shù)（C，包括1 次、2 次、3 次）等3 個(gè)變量進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計(jì)，以麝香草酚含量和浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用R 語(yǔ)言設(shè)計(jì)編程三因素三水平共17 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)、12個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)，收集數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 旋覆花提取工藝Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由表1 數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得均P＞0.05，相關(guān)系數(shù)R2=0.7387，模型可基本描述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由輸出數(shù)據(jù)得二次回歸方程為Y=19.45+0.14x1-0.36x2+0.80x3+0.05x1x2+0.04x1x3-0.46x2x3+1.23x12-0.11x22+0.09x32，方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小直接反應(yīng)各因素對(duì)指標(biāo)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映其影響方向。各因素對(duì)旋覆花提取影響的次數(shù)為C＞B＞A，即提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞料液比。其方差分析結(jié)果中失擬項(xiàng)（Lack of fit）P=0.7811＞0.05，說(shuō)明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合良好。根據(jù)駐點(diǎn)信息輸出可知，因素最佳水平為A=29.0965、B=41.8533、C=0.6152。按篩選最佳工藝料液比1∶30，提取時(shí)間40 min，提取1次進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，平均麝香草酚含量為0.29%，浸膏得率為18.21%，結(jié)果符合預(yù)測(cè)。

2.6 提取物不同干燥方式及抗氧化活性評(píng)價(jià)選擇的干燥方式有自然干燥、熱風(fēng)干燥、遠(yuǎn)紅外干燥、微波真空干燥及真空冷凍干燥。各干燥方式的參數(shù)為（1）自然干燥：在25～35 ℃通風(fēng)環(huán)境中自然晾干，每隔8 h 翻動(dòng)一下，當(dāng)水分低于10%時(shí)，即可停止；（2）熱風(fēng)干燥：置于60 ℃恒溫烘箱中，每隔2 h翻動(dòng)一下，風(fēng)速為3 m/s，當(dāng)水分低于10%時(shí)，即可停止；（3）遠(yuǎn)紅外干燥：置于60 ℃的遠(yuǎn)紅外烘箱（功率為2 kW）中，輻射距離200 mm，每隔1 h 翻動(dòng)一下，當(dāng)水分低于10%時(shí)，即可停止；（4）微波真空干燥：置于40 ℃微波真空干燥箱中，采用間歇式輻照方式即微波5 min，停止8 min，往復(fù)循環(huán)，每隔30 min翻動(dòng)一下，當(dāng)水分低于10%時(shí)，即可停止；（5）真空冷凍干燥：置于-40 ℃真空冷凍干燥箱中預(yù)凍6 h，而后將真空度調(diào)至70 Pa，當(dāng)水分低于10%時(shí)，即可停止?？寡趸钚栽u(píng)價(jià)以DPPH 自由基清除能力強(qiáng)弱為評(píng)價(jià)依據(jù)，按測(cè)試試劑盒方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中可知新鮮的旋覆花提取液的DPPH 自由基清除率達(dá)到73.5%，通過(guò)5 種干燥方式處理之后，清除率都有所下降，能力由低到高依次為自然干燥、熱風(fēng)干燥、遠(yuǎn)紅外干燥、微波真空干燥及真空冷凍干燥。

圖3 不同干燥方式對(duì)DPPH自由基清除率的影響

3 討論

本研究在單因素的基礎(chǔ)上，從料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)3 個(gè)主要因素考察了提取工藝，采用R 語(yǔ)言編程Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)，并對(duì)程序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，相比軟件分析（SPSS、Design Expert）更加精密；經(jīng)分析篩選，得出最佳的提取工藝，即料液比1∶30，提取時(shí)間40 min，提取1次。并且將該工藝重復(fù)進(jìn)行3次，所得麝香草酚含量和浸膏得率與預(yù)測(cè)值相符合，表明該工藝穩(wěn)定。

其次，對(duì)提取物的干燥方式進(jìn)行考察，以DPPH 自由基清除率的大小來(lái)評(píng)斷干燥方式的優(yōu)劣，從圖3 數(shù)據(jù)可知：真空冷凍干燥處理后的DPPH 自由基清除率最高；自然干燥相對(duì)時(shí)間漫長(zhǎng)，因此難以保證有效成分不被氧化，繼而抗氧化的能力降低；熱風(fēng)所采取的是高溫干燥，某些受熱不穩(wěn)定的酚酸類(lèi)成分結(jié)構(gòu)已被氧化，從而導(dǎo)致整體的抗氧化能力降低；遠(yuǎn)紅外是以光照進(jìn)行干燥的方式，光分解作用也是影響抗氧化能力的一種，因此結(jié)果表現(xiàn)出較弱的抗氧化能力；微波干燥在于波長(zhǎng)產(chǎn)生的熱能對(duì)成分有一定的影響；而真空冷凍干燥有著低溫、避光的特點(diǎn)，能盡可能地保護(hù)抗氧化成分不被破壞。

綜上所述，對(duì)旋覆花提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并以抗氧化活性評(píng)價(jià)提取物的干燥方式，對(duì)制備旋覆花中間體及開(kāi)發(fā)相關(guān)抗氧化產(chǎn)品都具有科學(xué)的指導(dǎo)意義。