葉聰，謝翡翡，李國衛(wèi)，胡綺萍，童培珍，吳潤松，羅文匯，孫冬梅*（1.廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510006；.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 5844）

苦杏仁、甜杏仁、桃仁均為薔薇科（Rosaceae）種子類中藥?？嘈尤蕿樗N薇科植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim、西伯利亞杏PrunussibiricaL.、東北杏Prunusmandshurica（Maxim.）Koehne 或杏PrunusarmeniacaL.的干燥成熟種子[1]；甜杏仁收載在甘肅省中藥材標準（2020年版）中[2]，為薔薇科植物杏Prunus armeniacaL.的干燥成熟種子，它的基原與苦杏仁的基原杏PrunusarmeniacaL.相同，但栽培方式不同，一般不作藥用，常作為食品、飲料的原料[1，3-4]；桃仁為薔薇科植物桃Prunuspersica（L.）Batsch 或山桃Prunusdavidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟種子。因3種藥材同為薔薇科植物種子類中藥，化學成分均以苦杏仁苷等苷類化合物為主，相似性較高，具有止咳平喘、潤腸通便等相似功效，但現(xiàn)代研究表明甜杏仁較苦杏仁藥力緩和，苦杏仁偏降氣止咳，甜杏仁偏于潤肺止咳，而桃仁長于活血化瘀，兼具潤腸通便、止咳平喘的功效，故三者不可混淆使用[5-7]。

苦杏仁、桃仁、甜杏仁的功能主治及臨床應(yīng)用范圍不同，但其外觀性狀相似，容易混淆，市場上存在將價格相對較低的苦杏仁摻入桃仁的問題[8]，而目前3種藥材的鑒別主要采用主觀性較強、依賴傳統(tǒng)經(jīng)驗的性狀鑒別方法，不能有效保障苦杏仁、桃仁的用藥有效性、安全性和甜杏仁的食品安全性，亟須建立一種簡便、快速、專屬性強的鑒別方法。本研究采用UPLC法建立了苦杏仁、甜杏仁、桃仁的特征圖譜鑒別方法，并對3種薔薇科種子類藥材的質(zhì)量進行了綜合研究，以期為苦杏仁、甜杏仁、桃仁的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZU LC-40D XS型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Thermo QE Focus Orbitrap型高分辨質(zhì)譜（美國賽默飛公司）；ME204E萬分之一天平、XP26百萬分之一天平（梅特勒-托利多公司），KQ500D數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HWS28型（恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥

苦杏仁苷（批號：110820-201808，含量：88.2%，中國食品藥品檢定研究院）；野黑櫻苷（批號：8781，含量：98.0%，上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司）；15批甜杏仁藥材為薔薇科植物杏P.armeniacaL.的干燥成熟種子，10批苦杏仁藥材為薔薇科植物東北杏P.mandshurica（Maxim.）Koehne、山杏P.armeniacaL.var.ansu Maxim.的干燥成熟種子，10批桃仁藥材為薔薇科植物桃P.persica（L.）Batsch、山桃P.davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟種子，上述樣品均由廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定，分別采集于河北、河南、山東、新疆、內(nèi)蒙古、山西、遼寧、陜西、甘肅等地，詳細信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

選擇Agilent ZORBAX SB-Aq（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）為色譜柱，以乙腈為流動相A，0.2%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，0%A；5～7 min，0%～3%A；7～20 min，3%～6%A；20～23 min，6%～80%A；23～28 min，80%A；28～30 min，80%～0%A；30～35 min，0%A）；流速為0.3 mL·min－1；柱溫為25℃；檢測波長為210 nm；進樣量為1 μL。

2.2 對照品溶液制備

取苦杏仁苷、野黑櫻苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為49.79、10.03 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

藥材粉碎，過二號篩。取35批苦杏仁、桃仁、甜杏仁藥材粉末各約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS條件

UPLC條件同“2.1”項下，用0.2%甲酸代替0.2%磷酸；質(zhì)譜采用ESI離子源，噴霧電壓3.24 kV，毛細管溫度為350℃，輔助氣溫度設(shè)置為350℃，采用正、負離子掃描模式，F(xiàn)ull MS全波長掃描模式，一級質(zhì)譜掃描范圍m/z：100～1000，分辨率為70 000，二級質(zhì)譜采用Top 20數(shù)據(jù)依賴模式選擇母離子進行裂解，碰撞能量為梯度碰撞電壓20 eV、30 eV、50 eV。

2.5 特征圖譜研究

2.5.1 精密度試驗 取甜杏仁（編號：N1）粉末按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以7號苦杏仁苷色譜峰為參照峰（S），計算各特征峰相對保留時間RSD為0.03%～0.10%，相對峰面積RSD為0.04%～1.4%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取甜杏仁粉末（編號：N1）按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣，以7號苦杏仁苷色譜峰為參照峰（S），計算各特征峰相對保留時間RSD為0.02%～0.10%，相對峰面積RSD為0.44%～1.8%，表明方法重復性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取甜杏仁粉末（編號：N1）按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，以7號苦杏仁苷色譜峰為參照峰（S），計算各特征峰相對保留時間RSD為0.03%～0.61%，相對峰面積RSD為1.3%～2.2%，表明方法重復性良好。

2.5.4 特征圖譜建立 取表1中35批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。分別將10批苦杏仁（東北杏、山杏）、10批桃仁（桃、山桃）、15批甜杏仁（杏）的圖譜數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”（2012版），以N1、K1、T1樣品作為參照圖譜，進行多點校正和峰匹配，采用中位數(shù)法分別生成甜杏仁（R1）、桃仁（R2）、苦杏仁（R3）的對照特征圖譜，如圖1所示；35批不同品種藥材疊加譜圖如圖2所示；分別計算相同品種的相似度系數(shù)，10批苦杏仁相似度均在0.942以上，10批桃仁相似度均在0.994以上，15批甜杏仁相似度均在0.946以上，計算結(jié)果見表2?？嘈尤屎?個特征峰、桃仁含有6個特征峰、甜杏仁含有6個特征峰，三者含有5個共有峰，分別為峰1、峰3、峰5、峰6、峰7?？赏ㄟ^峰4區(qū)分苦杏仁（東北杏、山杏）與甜杏仁（杏），可通過峰2區(qū)分苦杏仁（東北杏、山杏）與桃仁（桃、山桃）。

圖1 甜杏仁（R1）、桃仁（R2）、苦杏仁（R3）對照特征圖譜Fig 1 Reference characteristic chromatogram of sweet apricot kernel（R1），Persicae Semen（R2），and Armeniacae Semen Amarum（R3）

圖2 35批薔薇科種子類藥材UPLC疊加圖Fig 2 Overlay of UPLC for 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

表2 不同品種藥材樣品特征圖譜相似度評價結(jié)果Tab 2 Evaluation of similarity of characteristic chromatogram of different varieties of medicinal materials samples

2.5.5 共有峰指認 取苦杏仁、桃仁、甜杏仁藥材（K1、T1、N1）粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下條件進樣分析，得到的總離子流色譜圖（TIC）如圖3所示。根據(jù)目標峰的一級和二級信息與mzVault標準進行數(shù)據(jù)庫匹配分析，結(jié)合相關(guān)文獻研究，指認出峰1為扁桃酸酰胺-β-龍膽二糖苷，峰3為扁桃酸-β-龍膽二糖苷，峰5為野黑櫻苷，峰6為L-苦杏仁苷，峰7為苦杏仁苷。色譜峰的詳細質(zhì)譜信息見表3。

表3 甜杏仁樣品中色譜峰質(zhì)譜指認結(jié)果Tab 3 Identification of chromatographic peaks and mass spectrometry in sweet apricot kernel

取“2.2”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。通過甜杏仁藥材供試品與對照品的UPLC色譜圖比對，進一步證實峰5為野黑櫻苷，峰7為苦杏仁苷，結(jié)果見圖4。因苦杏仁苷為苦杏仁、桃仁、甜杏仁主要有效成分之一，且其分離度較好，峰面積最大，穩(wěn)定性較高，故選擇苦杏仁苷色譜峰為參照峰S。

圖4 甜杏仁樣品（N1）和對照品（R）UPLC圖Fig 4 UPLC of sweet apricot kernel（N1）and reference（R）

2.5.6 聚類分析 將35批樣品的7個特征峰峰面積（缺失峰的峰面積以0計算）導入Bioinformatics（www.bioinformatics.com.cn），并對相同特征峰的峰面積進行樣品間z-score歸一化處理，繪制得峰面積熱圖如圖5所示，圖中方格顏色及深淺代表樣品之間特征峰的峰面積差異，峰面積的差異可以反映相對含量的差異。由圖可見，除峰2外，苦杏仁、桃仁的特征峰峰面積總體上相較甜杏仁更高，且可見甜杏仁特征峰峰面積與其余兩者之間的差異更明顯。采用SPSS 25.0軟件對35批樣品色譜數(shù)據(jù)進行分析，以7個特征峰為變量（缺失峰的峰面積以0計算）、以平方歐氏距離為區(qū)間，采用組間連接法進行聚類分析，結(jié)果見圖6。同一品種不同產(chǎn)地的苦杏仁、甜杏仁、桃仁藥材質(zhì)量均較為一致。可見當組間距離為5時，35批樣品被分為3類，15批甜杏仁被聚為Ⅰ類，10批苦杏仁被聚為Ⅱ類，10批桃仁被聚為Ⅲ類。當組間距離為10時，桃仁和苦杏仁被聚集為一類，而甜杏仁單獨聚為另一類，說明相較于甜杏仁，桃仁與苦杏仁的上述7個特征峰對應(yīng)的化合物相對含量更為相近，進一步證實苦杏仁與甜杏仁雖然來源、功效相近，但由熱圖分析可見其特征峰所代表的化合物成分相對含量具有一定的差異，基于峰面積的聚類分析可以通過這些差異準確地將10批苦杏仁和15批甜杏仁聚類為兩組。聚類分析結(jié)果與特征圖譜鑒別一致。

圖5 35批薔薇科種子藥材7個特征峰峰面積熱圖Fig 5 Heat maps of 7 characteristic peak areas of 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

圖6 35批薔薇科種子藥材聚類分析結(jié)果Fig 6 Cluster analysis of 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

2.5.7 正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA） 以7個特征峰的峰面積作變量（缺失峰的峰面積以0計算），采用SIMCA為14.1對35批樣品色譜數(shù)據(jù)進行判別分析，得到2個主成分，各主成分因子載荷圖見圖7，色譜峰7距離原點最遠，說明苦杏仁苷成分含量為分類3種薔薇科藥材的重要變量。建立的OPLS-DA模型的R2X為0.938，R2Y為0.884，Q2為0.861，均＞0.5，說明所建立的模型預測能力及穩(wěn)定性較好。通過200次置換檢驗得到R2在Y軸上的截距為－0.042，小于0.3，說明模型擬合較好；Q2在Y軸上的截距為－0.261，小于0.05，說明模型未過度擬合，置換檢驗結(jié)果見圖8。35批樣品得分圖見圖9，可見35批樣品被聚為3類，15批甜杏仁聚為一類，10批苦杏仁聚為一類，10批桃仁聚為一類，實現(xiàn)了3種薔薇科藥材的區(qū)分；為進一步明確區(qū)別不同品種藥材的標志性成分，以VIP值＞1作為標準，篩選出了1個差異性成分，為峰7，即苦杏仁苷，進一步證實苦杏仁苷對區(qū)分3種薔薇科藥材的貢獻較大，VIP值圖見圖10。

圖7 因子載荷圖Fig 7 Factor load diagram

圖8 置換檢驗結(jié)果Fig 8 Replacement test results

圖9 35批薔薇科種子藥材OPLS-DA 散點圖Fig 9 Scatter plot of OPLS-DA for 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

圖10 35批薔薇科種子藥材OPLS-DA VIP值圖Fig 10 OPLS-DA VIP values of 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

3 討論

3.1 色譜條件的考察

本研究考察了不同流動相（乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液）及檢測波長（PDA檢測器波長范圍：190～400 nm）下各色譜峰的峰形和分離效果，最終確定以乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相體系，在210 nm檢測波長條件下色譜圖中色譜峰分離度較好，響應(yīng)值較高，基線平穩(wěn)。

3.2 提取方法的選擇

本研究以“色譜峰總峰面積/稱樣量”及色譜圖峰形為評價指標，最終確定提取溶劑70%甲醇，提取方式為加熱回流，提取時間為30 min，作為3種薔薇科藥材特征圖譜的供試品溶液制備方法。

3.3 特征圖譜結(jié)果分析

本研究建立了35批薔薇科藥材的特征圖譜，確定甜杏仁藥材含有6個特征峰、苦杏仁含有7個特征峰、桃仁含有6個特征峰。通過對照品比對、相關(guān)文獻研究及質(zhì)譜指認初步指認其中5個共有峰，分別為扁桃酸酰胺-β-龍膽二糖苷（峰1）、扁桃酸-β-龍膽二糖苷（峰2）、野黑櫻苷（峰5）、L-苦杏仁苷（峰6）、苦杏仁苷（峰7），通過對照品進一步證實峰5為野黑櫻苷，峰7為苦杏仁苷。野黑櫻苷在體內(nèi)可作為原形成分被吸收，具有抗纖維化的作用[11]；苦杏仁苷代謝分解后產(chǎn)生的極微量氫氰酸有鎮(zhèn)咳平喘之用，但過量則會對人體產(chǎn)生毒害[6]。本研究構(gòu)建3種薔薇科種子藥材的特征圖譜可通過觀察峰2、峰4的存在區(qū)分甜杏仁（杏）、苦杏仁（東北杏、山杏）、桃仁（桃、山桃），但這2個色譜峰的指認還有待進一步研究鑒定。由熱圖分析可見10批苦杏仁與15批甜杏仁的苦杏仁苷相對含量差異較大，可進一步對苦杏仁苷進行定量分析，通過苦杏仁苷的含量鑒別基原相同的甜杏仁與苦杏仁。

3.4 化學計量學分析

本研究采用聚類分析和OPLS-DA分析2種方法對3種薔薇科藥材進行了判別分析。在組間距離為5時，35批薔薇科藥材準確聚為3大類，15批甜杏仁藥材N1～N15聚為Ⅰ類，10批苦杏仁藥材K1～K5聚為Ⅱ類，10批桃仁藥材T1～T5聚為Ⅲ類，說明甜杏仁、苦杏仁、桃仁等不同品種藥材之間化學成分差異較大，提示準確鑒別3種薔薇科種子對苦杏仁、桃仁的用藥安全性及臨床有效性具備重要意義。根據(jù)基于特征峰峰面積的OPLS-DA分析，甜杏仁、桃仁、苦杏仁分別聚集成3大類，結(jié)果與特征圖譜分析、聚類分析相互印證。VIP值在OPLS-DA分析中用來衡量變量對于區(qū)分兩個或多個類別的重要性，VIP值越高，表示該化合物對于區(qū)分不同類別的貢獻越大，VIP值高的化合物通?？梢哉f明該化合物的含量差異是區(qū)別兩個類別的重要因素。以VIP值＞1為標準篩選出苦杏仁、桃仁、甜杏仁的差異性標志物為苦杏仁苷（峰7），提示苦杏仁苷含量的差異是區(qū)別3種藥材的重要因素。

4 結(jié)論

本研究建立了苦杏仁、桃仁、甜杏仁的UPLC特征圖譜鑒別方法，通過化學計量學比較了3種藥材之間的化學成分差異，可以快速、準確區(qū)分甜杏仁、苦杏仁、桃仁藥材，為3種薔薇科藥材的鑒別和薔薇科種子藥材資源的進一步研究提供了依據(jù)。