龔受基，覃 媚，戴梓茹，蔣紅明，郭德軍,

（1.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院，廣西欽州 535011；2.廣西高校北部灣海產(chǎn)品高值化利用與預(yù)制食品重點實驗室，廣西欽州 535011；3.欽州市特色果蔬發(fā)酵重點實驗室，廣西欽州 535011）

相思藤，中藥大辭典記載其為豆科相思子屬植物相思子（Abrus precatoriusLinn.）[1]，以根藤入藥，有清熱解毒、消炎利尿、潤肺護肝功效。相思藤主要分布于廣西、廣東、福建、云南和臺灣等地山地疏林中[2]，在廣西欽州、南寧、玉林等地已有大規(guī)模人工種植并將枝葉開發(fā)為相思藤茶，相思藤茶茶湯純凈金黃、清甜回甘、淡香清爽、風(fēng)味獨特，深受消費者歡迎。文獻報道從相思藤根莖葉果等分離得到100 多個化學(xué)成分，主要為黃酮、生物堿、甾體和三萜皂苷等[3-5]，具有保護肝損傷[6]、抗腫瘤[7-8]、抗菌[9]和降血糖[10]等作用，主要活性物質(zhì)為黃酮類、脂溶成分和蛋白質(zhì)等。相思藤能夠成為消費者歡迎的類茶飲料，與其清甜回甘特性有很大關(guān)系，甜味成分來源于環(huán)烷型皂苷[11]，與羅漢果甜苷具有類似苷元結(jié)構(gòu)。陳紅霞等[6]認(rèn)為相思藤總黃酮對CCl4、對乙酰氨基酚（AP）和D-半乳糖胺（D-GalN）所致小鼠急性化學(xué)性肝損傷有保護作用，顯著降低ALT、AST 活性，抑制MDA 的生成，明顯提高肝組織GSH 水平和GSHPX 活性（P＜0.05），作用機制可能與清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。其他研究發(fā)現(xiàn)相思藤葉、果實、果實殼成分都具有較好的抗氧化效果[12-13]。自由基在調(diào)節(jié)宿主防御、衰老和凋亡等生理過程發(fā)揮重要作用，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色[14]，而目前相思藤抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)和機制并不清楚。黃酮類物質(zhì)具有多種生理活性，可以通過乙醇浸泡，超聲波、微波、高壓脈沖電場輔助方法提取，也可以通過超臨界流體萃取。微波、高壓脈沖電場輔助和超臨界流體萃取因設(shè)備要求高、價格貴導(dǎo)致目前應(yīng)用難以普及，超聲波輔助提取法因操作方便、設(shè)備簡單、可在室溫進行等優(yōu)點得到廣泛應(yīng)用[15]。本文探索超聲波輔助乙醇提取相思藤黃酮的工藝及其體外抗氧化作用，期望能夠為相思藤的深入開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

相思藤（Abrus precatoriusLinn.）購自廣西欽州市城東市場；2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）阿拉丁試劑（上海）有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）上海西寶生物科技有限公司；其他試劑均為分析純試劑。

VC505 超聲波破碎儀 美國SONICS 公司產(chǎn)品；EVOLUTION 201 紫外分光光度計 美國Thermo公司產(chǎn)品；EU-C 4002 RS D 型高精度電子分析天平

德國GIBERTINI 公司產(chǎn)品；DZF-6030A 真空干燥箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 相思藤黃酮提取及純化 將相思藤和500 mL石油醚置于索氏回流裝置中，進行回流萃取葉綠素2 h 后晾干。分別稱取1.0 g 去除葉綠素樣品，在不同乙醇濃度、料液比、超聲能量和超聲時間等條件下進行黃酮提取工藝研究。

取去除葉綠素的相思藤粉碎，按上述單因素研究所確定的最優(yōu)工藝進行總黃酮提取，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮除去乙醇至粘稠狀，加入10 倍量水稀釋濃縮液并抽濾除去不溶物。處理好的D-101 大孔吸附樹脂填充于1.5 cm×34 cm 層析柱并平衡，將過濾液以4 mL/min 速度上樣，上樣體積50 mL，先以9 倍量柱體積水洗脫除雜，用70%乙醇以1 mL/min 速度洗脫，收集12 倍量柱體積乙醇洗脫液，濃縮、冷凍干燥得粗黃酮[16]，檢測得粗黃酮中總黃酮含量為65.86%。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品黃酮得率測定參照夏雨弘等[17]方法并加以改進，分別量取濃度為2.0 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL于10 mL 刻度管中，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，靜置6 min，然后加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，靜置6 min，再加入4% NaOH 溶液4.0 mL，靜置15 min，最后加入50%乙醇定容至10 mL，暗處靜置30 min，于波長510 nm 處測定吸光值，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制蘆丁濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度與濃度的回歸方程為y=0.0011x-0.0067，R2=0.9991，蘆丁對照品濃度范圍為0～400 μg/mL 時，吸光度和濃度呈現(xiàn)比較好的線性關(guān)系。

黃酮提取液進行抽濾，濾液定容至60 mL，分別吸取各樣品1.0 mL，按照上述操作測量樣品吸光度，計算樣液中總黃酮含量和得率[18]。

1.2.3 單因素實驗條件

1.2.3.1 乙醇濃度對相思藤黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取相思藤樣品1.0 g，固定超聲時間40 min、料液比（W/V）1:30 和超聲能量450 J，乙醇濃度分別選用50%、60%、70%、80%、90%等5 個水平提取相思藤黃酮，計算黃酮得率。

1.2.3.2 料液比對相思藤黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取相思藤樣品1.0 g，固定超聲能量450 J、乙醇濃度80%、超聲時間40 min，料液比（W/V）分別選用1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 等5 個水平提取相思藤黃酮，計算黃酮得率。

1.2.3.3 超聲時間對相思藤黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取相思藤樣品1.0 g，固定超聲能量450 J、乙醇濃度80%和料液比（W/V）1:50，超聲時間分別選用20、30、40、50、60 min 等5 個水平提取相思藤黃酮，計算黃酮得率。

1.2.3.4 超聲能量對相思藤黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取相思藤樣品1.0 g，固定超聲時間40 min、乙醇濃度80%和料液比（W/V）1:50，超聲能量分別選用350、400、450、500、550 J 這5 個水平提取相思藤黃酮，計算黃酮得率。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 以黃酮得率為考察指標(biāo)，對黃酮得率最高水平與相鄰水平進行組間比較，根據(jù)影響顯著性設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗（表1）。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Design factors and levels of response surface experiment

1.2.5 抗氧化能力的測定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除能力測定 用無水乙醇配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的黃酮溶液及0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mg/mL 的Trolox標(biāo)準(zhǔn)液，各取5 mL 置于刻度管中，配制濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，向黃酮樣品和Trolox 刻度管中加入現(xiàn)配的DPPH 溶液5.0 mL，將刻度管置于暗處反應(yīng)30 min 后，在517 nm 處測定吸光值，計算黃酮和Trolox 對DPPH 自由基的清除率、EC50[19]。

式中C—DPPH 自由基清除率，A1—空白溶液的吸光度，A2—樣品溶液的吸光度。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力測定 吸取7.4 mmol/L 的ABTS 原液25.0 mL 與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液25.0 mL 混合，在暗處反應(yīng)16 h。吸取濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的黃酮溶液各1 mL，加入配置好的ABTS+工作液5.0 mL，混勻后靜置5 min，在734 nm 處測其吸光度，用無水乙醇作為空白對照，采用相同方法吸取0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mg/mL 的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)液進行反應(yīng)測定。計算黃酮和Trolox對ABTS+自由基的清除率、EC50[17]。

式中，A1為空白溶液的吸光度，A2為樣品溶液的吸光度。

1.2.5.3 FRAP 的測定 分別吸取濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的黃酮溶液60 μL 于刻度管中，在每個刻度管中加入5 mL 的FRAP 試劑，混和均勻后置于37 ℃水浴20 min，在595 nm 處測其吸光度，以Trolox 為對照進行對比分析[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗和抗氧化實驗數(shù)據(jù)采用Origin 9.1進行整理和繪圖；響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)利用Design-Expert 10 軟件中的Box-Behnken 進行回歸模型方程的建立及方差分析，實驗均重復(fù)三次；使用SPSS 20.0 軟件進行組間方差分析及顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對相思藤黃酮得率的影響

2.1.1 乙醇濃度對相思藤黃酮得率的影響 在固定的工藝組合條件下，改變乙醇濃度，考察乙醇濃度對相思藤黃酮提取得率的影響。當(dāng)乙醇濃度在50%至80%時，隨著乙醇濃度增加，相思藤黃酮得率慢慢增加。當(dāng)乙醇濃度達到80%時，相思藤黃酮得率接近最高值。乙醇濃度超過80%，相思藤黃酮得率減小，80%乙醇提取得率與70%、90%比較具有顯著性差異（P＜0.001），如圖1A 所示。不同材料使用乙醇提取時，獲得最高提取率的乙醇濃度存在差異，小二仙草在75%時提取率最高[17]，黃花菜于90%～95%乙醇濃度時提取率最高[13]，野葛在50%的乙醇中提取率最高[11]，而本實驗用80%乙醇提取相思藤黃酮得率最高，造成這些差異的原因尚不清楚，猜測可能與材料結(jié)構(gòu)細(xì)胞致密度相關(guān)。本實驗根據(jù)單因素結(jié)果對70%～90%的乙醇進行超聲提取相思藤黃酮響應(yīng)面研究。

圖1 乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲能量對黃酮得率的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction,solid-liquid ratio,ultrasonic extracting time and ultrasonic energy on the extraction rate of flavonoids from Abrus precatorius Linn

2.1.2 料液比對相思藤黃酮得率的影響 改變料液比考察其對提取相思藤黃酮得率的影響，當(dāng)料液比（W/V）在1:20 至1:40 時，隨著料液比改變，相思藤黃酮得率快速增加。當(dāng)料液比（W/V）超過1:40 時候，相思藤黃酮得率趨于平衡，見圖1B，有學(xué)者認(rèn)為當(dāng)料液比達到一定值后，黃酮能充分溶出，其他成分溶出相對較少，提取液比例增加后，雜質(zhì)溶出增加，與黃酮結(jié)合沉淀，黃酮得率反而降低[21]。本試驗中得率最高水平與相鄰水平1:40、1:50、1:60 三個水平實驗中，最高值和最低值相差2.0%，沒有顯著性差異。野葛在1:15～1:20 的料液比區(qū)間提取黃酮得率最高[11]，小二仙草在1:40 時得率最高[17]。本實驗中1:40～1:60 的料液比對相思藤黃酮得率的影響差別40～60 min 時，相思藤黃酮得率隨超聲時間增加而減少，如圖1C 所示。超聲外場的引入，使細(xì)胞壁更易出現(xiàn)裂縫，更易破碎，提高孔隙率，增大溶劑與固體基質(zhì)的接觸面積，并且隨著超聲處理時間的延長，細(xì)胞破壁受損情況也更加明顯,從而有效成分的溶解也就更加完全，提取效率更高[22]。但黃酮能通過氫鍵、疏水吸引和其他相互作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，超聲使蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水基團外露[23-24]，增加兩者結(jié)合[25]，反而導(dǎo)致黃酮得率下降。所以超聲時間確定為30、40、50 min，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗研究。不大，所以在響應(yīng)面試驗中直接選用料液比（W/V）為1:50 進行后續(xù)研究。

2.1.3 超聲時間對相思藤黃酮得率的影響 超聲時間在40 min 時相思藤黃酮得率最高，在20～40 min時，相思藤黃酮得率隨超聲時間增加而增加。在

2.1.4 超聲能量對相思藤黃酮得率的影響 黃酮得率不但與超聲時間相關(guān)，而且也與超聲能量相關(guān)。當(dāng)超聲能量小不足以破壞細(xì)胞壁時，細(xì)胞內(nèi)有效成分僅通過細(xì)胞壁及細(xì)胞膜依靠濃度差進行滲透釋放，當(dāng)超聲能量足夠大，除了加速細(xì)胞壁裂縫產(chǎn)生和發(fā)展，而且促使細(xì)胞膨脹至破裂，細(xì)胞內(nèi)成分直接暴露進入溶劑中，大大提高溶出率及溶出速率[22]。本研究中超聲能量在350～500 J 時，隨超聲能量增加相思藤黃酮得率增加，在500 J 時相思藤黃酮得率趨向最大值。超聲能量超過500 J，相思藤黃酮得率減小，如圖1D 所示。故選用超聲能量為450、500、550 J 作為研究相思藤黃酮超聲提取的響應(yīng)面分析比較合適。

在各單因素研究中，黃酮得率分別出現(xiàn)了最大值，與得率最大值水平比較，70%和90%乙醇濃度的黃酮得率、30 和50 min 的黃酮得率有顯著性差異（P＜0.001），450 和550 J 的黃酮得率有顯著性差異（P＜0.05），而1:40 和1:60 料液比的黃酮得率與1:50水平比較沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 單因素的實驗結(jié)果比較分析表明，對相思藤黃酮得率影響顯著的因素是乙醇濃度、超聲時間、超聲能量，以上述三個因素為自變量，相思藤黃酮得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件的Box-Behnken 模型設(shè)計三水平三因素的響應(yīng)面分析試驗，響應(yīng)面分析方案及結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experimental

對黃酮得率的結(jié)果進行擬合，得到相思藤黃酮得率對乙醇濃度（A）、超聲時間（B）和超聲能量（C）的二次多項式回歸方程模型：

對回歸模型進行方差分析，模型的F值為36.02，P＜0.0001，故該模型極顯著，即對相思藤黃酮得率的影響較為顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。失擬誤差的P=0.2104＞0.05，可以看出該模型與實際試驗擬合良好，誤差小，模型的R2=0.9789，R2Adj=0.9517，說明該模型可以解釋97.89%的黃酮得率變化，大概有2.1%的變化不能得到合理解釋，表明預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果的一致性較好。由表計算各因素的P值，PA=0.0003，PB=0.0123，PC=0.0051。P值越小，影響越明顯，所以各因素對相思藤黃酮得率的影響程度為乙醇濃度（A）＞超聲能量（C）＞超聲時間（B）。乙醇濃度的二次項和超聲能量的二次項的P值都小于0.0001，達到了極顯著水平。乙醇濃度與超聲時間、乙醇濃度與超聲能量的交互作用的PAB、PAC均小于0.05，交互作用顯著，超聲時間與超聲能量交互作用PBC＝0.1983，大于0.05，交互作用不顯著，見表3。

表3 響應(yīng)面試驗的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression simulation

2.2.2 各因素間交互作用的響應(yīng)面分析 利用Design-Expert 8.0.6 Trial 自身所帶軟件對各因素之間的交互作用做響應(yīng)面分析，得到響應(yīng)面曲線如圖2。觀察響應(yīng)面坡度，如果響應(yīng)面的坡度是陡峭的，說明兩個因素交互作用對相思藤黃酮得率的影響顯著，坡度平緩，則影響非顯著。坡度最陡的是乙醇濃度和超聲能量響應(yīng)面圖2B，乙醇濃度和超聲時間的響應(yīng)面坡度比較陡如圖2A，超聲時間和超聲能量響應(yīng)面的坡度較平緩圖2C，說明乙醇濃度和超聲時間、乙醇濃度和超聲能量交互作用對相思藤黃酮提取的影響顯著，而超聲時間和超聲能量交互作用對相思藤黃酮提取的影響不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖2 乙醇濃度、超聲時間和超聲能量交互作用對黃酮得率的影響Fig.2 Interactive effects of ethanol volume fraction,ultrasonic extracting time and ultrasonic energy on the extraction rate of flavonoids from Abrus precatorius Linn

2.2.3 驗證試驗 為了確定各因素的最優(yōu)值，采用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件中的Optimization 的Numerical 功能，在模型因素的取值范圍內(nèi)，選取最大的響應(yīng)值。提取相思藤黃酮得率最優(yōu)條件為：乙醇濃度為82.0%，超聲時間為42.1 min，超聲能量為507.4 J，此時黃酮得率為0.70%。根據(jù)實際的操作條件，將最優(yōu)條件參數(shù)進行修正，選擇提取相思藤黃酮得率最優(yōu)的條件為：乙醇濃度為82%，超聲時間為42 min，超聲能量為507 J。為了驗證響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果的可靠性，選用修正的最優(yōu)提取條件，進行三次驗證試驗，黃酮得率的平均值為0.696%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.605%，說明試驗值與理論值沒有顯著差別。

2.3 相思藤黃酮的抗氧化能力

隨著相思藤黃酮和Trolox 濃度增加，F(xiàn)RAP 值增加，亞鐵離子還原能力與黃酮、Trolox 含量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。相思藤黃酮濃度為0.5 mg/mL 時對鐵離子的還原力為2.42 mmol/L，Trolox 濃度為0.5 mg/mL 時對鐵離子的還原力為2.76 mmol/L，Trolox 在較低濃度時的FRAP 響應(yīng)值和較高濃度的相思藤黃酮的FRAP 值相當(dāng)，見圖3?？梢娤嗨继冱S酮的鐵離子還原能力要弱于Trolox，但與苦筍黃酮還原能力相當(dāng)[26]，優(yōu)于化橘紅[27]，遠優(yōu)于黃花菜、百香果皮和牛大力[28-30]，綜合來看相思藤黃酮對亞鐵離子的還原能力較好。

圖3 相思藤黃酮對鐵離子的還原能力Fig.3 Reduing activity to iron ions of flavonoids from Abrus precatorius Linn

相思藤黃酮具有較好的清除DPPH 自由基能力，濃度在0.1～0.5 mg/mL 范圍內(nèi)與DPPH 自由基清除率有良好的線性關(guān)系，清除DPPH 自由基EC50為0.028 mg/mL，見表4。Trolox 是水溶性維生素E，具有強效抗氧化作用，常用作食品、飲料和補充劑的抗氧化能力陽性對照，其EC50值0.094 mg/mL。相思藤黃酮的EC50小于Trolox，清除DPPH 自由基能力優(yōu)于Trolox。相思藤黃酮清除DPPH EC50值與小二仙草相當(dāng)[17]，清除DPPH 自由基能力優(yōu)于陳艾和野葛總黃酮[31-32]，遠優(yōu)于山茱萸、黃花菜、百香果皮、黃晶果果皮和羅漢參皮等黃酮[28-29,33-35]，但比三葉木通黃酮效果差[36]。

表4 Trolox 和相思藤黃酮抗氧化能力Table 4 Antioxidant activity of Trolox and flavonoids from Abrus precatorius Linn

相思藤黃酮在0.05～0.25 mg/mL 范圍內(nèi)與ABTS+自由基清除率有良好的線性關(guān)系，具有優(yōu)秀的清除ABTS+自由基能力，半數(shù)清除有效濃度EC50為 0.009 mg/mL，而 Trolox 對 ABTS+的 EC50為0.015 mg/mL，見表4，顯然相思茶黃酮對ABTS+的清除效果明顯優(yōu)于Trolox。與其他植物類黃酮相比，相思藤黃酮清除ABTS+自由基能力優(yōu)于新疆圓柏[37]，遠優(yōu)于羅漢參皮、黃晶果果皮、黃花菜和百香果皮[28-29,33-34]等黃酮，與牛大力[30]黃酮能力相當(dāng)。

相思藤果油（EC 分別為DPPH 5.03 mg/mL、ABTS+2.95 mg/mL）和果殼油（EC 分別為DPPH 3.03 mg/mL、ABTS+3.07 mg/mL）[13]有一定的清除自由基效果，但比相思藤黃酮差?？傮w上相思藤黃酮具有較好的抗氧化能力。

3 結(jié)論

相思藤中總黃酮含量較高，利用響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化相思藤黃酮提取條件切實可行，在乙醇濃度82%，超聲時間42 min，超聲能量為507 J，黃酮得率為0.696%。

以Trolox 作為抗氧化研究對照，體外測定Trolox和相思藤黃酮清除DPPH 自由基的EC50分別為0.094、0.028 mg/mL，清除ABTS+自由基的EC50分別為0.015、0.009 mg/mL；相思藤黃酮濃度為5 mg/mL 時對鐵離子的還原力為2.42 mmol/L，弱于Trolox。本研究證實相思藤黃酮具有較好的清除自由基能力和還原能力，是潛在的植物源抗氧化劑，研究結(jié)果為相思藤黃酮的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。