石金明，王曉明，李凌云，董華發(fā)，劉雅夫,

（1.廣東愛健康生物科技有限公司，廣東清遠(yuǎn) 511873；2.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東云浮 527400）

雞肉具有低脂肪、高蛋白優(yōu)點(diǎn)，鮮美細(xì)嫩的肉質(zhì)使其受到消費(fèi)者的青睞[1]。2021 年我國(guó)雞肉產(chǎn)量為1470 萬(wàn)噸，位居世界第二[2]。在我國(guó)禽肉消費(fèi)市場(chǎng)主要有兩大品類，即白羽肉雞及黃羽肉雞。白羽肉雞產(chǎn)業(yè)是中國(guó)畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中規(guī)?；B(yǎng)殖程度最高的產(chǎn)業(yè)，經(jīng)過(guò)多年產(chǎn)業(yè)發(fā)展與技術(shù)升級(jí)，白羽肉雞屠宰可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化流水線作業(yè)，每小時(shí)屠宰產(chǎn)能可達(dá)1 萬(wàn)只以上，市場(chǎng)流通產(chǎn)品以冰鮮分割品及調(diào)理品為主。黃羽肉雞又稱國(guó)雞主要以我國(guó)地方品種為主，市場(chǎng)流通主要以毛雞為主，黃羽肉雞體重較白羽肉雞小且均勻度差，未能像白羽肉雞一樣實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化流水線屠宰作業(yè)，屠宰關(guān)鍵工序掏膛主要依賴人工，屠宰水平差異導(dǎo)致黃羽肉雞屠宰加工產(chǎn)業(yè)在發(fā)展過(guò)程中會(huì)比白羽肉雞產(chǎn)業(yè)存在更多痛點(diǎn)。目前，我國(guó)部分城市的主城區(qū)開始限制活禽交易，主張家禽“集中屠宰，冷鮮上市”[3]。在理想情況下，雞的肌肉組織中不存在微生物，然而在屠宰過(guò)程中，會(huì)不可避免地從各種污染源（如皮膚、羽毛、糞便、刀具、臺(tái)面、操作工人的手等）帶入微生物到肉雞胴體及其分割產(chǎn)品中[4-5]。集中屠宰過(guò)程中因屠宰量大，且部分屠宰場(chǎng)環(huán)境比較落后，很容易造成微生物的交叉污染[3]。冷鮮雞肉加工過(guò)程溫度相對(duì)較低，使得大部分微生物粘附于其胴體表面，易導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)，縮短其貨架期，甚至引發(fā)食品安全問(wèn)題[6]。比起貯藏溫度，生產(chǎn)過(guò)程中良好的操作和預(yù)冷方式對(duì)貨架期的延長(zhǎng)更具關(guān)健作用[7]。湯飛[8]從安徽省宣城地區(qū)所產(chǎn)雞肉中分離出大腸菌群，假單胞菌，乳酸菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌等。王光宇[9]發(fā)現(xiàn)雞肉上的腐敗菌主要有假單胞菌和氣單胞菌。Laconi 等[10]從雞肉中分離出空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌。

關(guān)于雞肉中菌種的分離鑒定主要有兩種方法，傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定法和高通量測(cè)序鑒定法[11]。傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定法指的是將稀釋后的菌液均勻涂布在各種特異性選擇性培養(yǎng)基上，然后通過(guò)肉眼觀察，挑選出單菌落并置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后純化分離并提取DNA[12]。僅僅憑肉眼去觀察和挑取菌落，主觀性比較強(qiáng)，很容易遺漏部分菌株[12-13]。高通量測(cè)序技術(shù)指的是不需要通過(guò)培養(yǎng)細(xì)菌，就能準(zhǔn)確的分析出樣品中微生物的多樣性。它可以在短時(shí)間內(nèi)生成數(shù)千個(gè)序列，還能覆蓋復(fù)雜的和低豐度的微生物，因此該技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)一些傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定方法中無(wú)法檢測(cè)出的微生物[14]。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品加工、土壤、水質(zhì)和腸道菌群等相關(guān)樣品的微生物多樣性分析[15]。

前期的研究大多以白羽肉雞為實(shí)驗(yàn)原料，因此，本試驗(yàn)以黃羽雞為研究對(duì)象，利用平板傾注法及Illumina MiSeq 高通量測(cè)序測(cè)定高效地確定黃羽肉雞宰過(guò)程中加工環(huán)境和胴體表面腐敗菌的多樣性，研究了屠宰至加工的各個(gè)過(guò)程中雞肉的表面，以及其可能接觸到的各個(gè)臺(tái)面的細(xì)菌。旨在分析黃羽肉雞屠宰加工環(huán)節(jié)的肉雞胴體菌群組成，將為黃羽肉雞屠宰企業(yè)提高肉雞屠宰衛(wèi)生品質(zhì)、延長(zhǎng)貯藏期奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，為黃羽肉雞屠宰技術(shù)提升和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供研究數(shù)據(jù)和研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃羽雞 溫氏食品集團(tuán)股份有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar）北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 NextSeq 500 高通量測(cè)序儀 美國(guó)illumina 公司；TG16-WS 型臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LRH-250-HS 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 沈陽(yáng)亮衡天平儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 為了分析黃羽雞屠宰過(guò)程各工藝中胴體及所接觸臺(tái)面的菌群組成，選取屠宰加工過(guò)程的黃羽雞為試驗(yàn)樣品，并對(duì)所接觸的臺(tái)面進(jìn)行擦拭以獲得黃羽雞接觸臺(tái)面的菌相。本文在屠宰工藝流程取樣點(diǎn)（打毛后（DM）；凈膛后（JH）；凈膛消毒后（CH）；預(yù)冷后（YH）；次氯酸電解水處理后（DH）；分級(jí)后成品（BZ）；對(duì)照（CN））每個(gè)點(diǎn)隨機(jī)選取三只去毛掏膛后的黃羽雞進(jìn)行微生物檢測(cè)。在接觸面（凈膛工人手套（JS）、分級(jí)秤的表面（BC）、分級(jí)車間臺(tái)面（BT）、分級(jí)車間工人手套（BS）、預(yù)冷池內(nèi)表面（YB）、預(yù)冷池內(nèi)角（YJ））取樣進(jìn)行微生物檢測(cè)，測(cè)定在不同工藝點(diǎn)的胴體和接觸面所取的樣品的菌落總數(shù)及假單胞菌數(shù)。同時(shí)將洗菌后菌懸液離心獲得菌泥并保存于-80 ℃，用于菌群多樣性分析。

1.2.2 屠宰工藝流程點(diǎn)測(cè)試菌液制備 在屠宰工藝流程的不同取樣點(diǎn)隨機(jī)選取黃羽肉雞3 只。將稱重后的每只黃羽肉雞胴體與同質(zhì)量無(wú)菌生理鹽水加入到無(wú)菌取樣袋，室溫條件下200 r/min 振蕩10 min。然后吸取1 mL 菌懸液加入9 mL 滅菌生理鹽水中進(jìn)行十倍梯度稀釋，制備測(cè)試菌液。

1.2.3 加工環(huán)境表面測(cè)試菌液制備 選擇加工環(huán)境取樣點(diǎn)與肉雞胴體直接接觸的暴露面為取樣點(diǎn)，將棉簽在5 cm×5 cm 的取樣器范圍內(nèi)擦拭，取樣后置入裝有225 mL 無(wú)菌水的均質(zhì)袋中，室溫條件下200 r/min 振蕩10 min。重復(fù)取樣三次。振蕩混勻后，對(duì)菌懸液十倍稀釋制備測(cè)試菌液。

1.2.4 菌落總數(shù)的測(cè)定 參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定菌落總數(shù)，對(duì)30～300 CFU 之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)[16-17]。

1.2.5 高通量測(cè)序 將上述不同屠宰工藝點(diǎn)及接觸表面獲得的菌液在4 ℃離心10 min（2000 r/min）進(jìn)行第一次離心，然后吸取上清液于4 ℃、12000 r/min離心10 min 進(jìn)行第二次離心，將第二次獲得菌泥并放入冰箱中，-80 ℃保存。選取引物338F（5’-ACT CCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACT ACNNGGG TATCTAAT-3’）對(duì)細(xì)菌的V3-V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。利用Illumina Miseq 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行樣品的測(cè)序。將相似性高于97%的測(cè)序樣品中的物種進(jìn)行分類單元操作（operational taxonomic units，OTU）[18]。然后，將所測(cè)得的OTU 與Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)里的信息進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)的物種多樣性信息。并計(jì)算分析alpha 多樣性中的各個(gè)指數(shù)（Chao1、Observed_species、PD_whole_tree 及 Shannon）。利 用UniFrac 算法對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化的信息進(jìn)行比較各個(gè)樣品間微生物菌群的差異性，并進(jìn)行Beta 多樣性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著。使用Origin 2018C 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰過(guò)程中肉雞胴體表面菌數(shù)變化

屠宰過(guò)程中各工藝點(diǎn)的黃羽雞胴體總菌數(shù)變化如圖1 所示。由圖1 所示，在黃羽雞屠宰流程中，經(jīng)打毛后黃羽肉雞胴體的菌落總數(shù)為4.43 lg（CFU/g），凈膛后菌落總數(shù)為4.87 lg（CFU/g），這可能是因?yàn)閮籼胚^(guò)程存在外源操作及腸道菌群污染的幾率。凈膛后胴體經(jīng)過(guò)次氯酸鈉溶液清洗后，菌落總數(shù)降為4.28 lg（CFU/g），經(jīng)預(yù)冷后菌落總數(shù)回升至4.58 lg（CFU/g），說(shuō)明預(yù)冷槽成為黃羽雞胴體菌落總數(shù)增長(zhǎng)的第二個(gè)污染點(diǎn)。經(jīng)分級(jí)篩選后，胴體菌落總數(shù)再次上升至4.63 lg（CFU/g）。由圖1 可知，凈膛、預(yù)冷及分級(jí)篩選是黃羽肉雞菌數(shù)增長(zhǎng)的主要污染源，在屠宰過(guò)程中需關(guān)注以上工序衛(wèi)生操作及微生物控制。

圖1 黃羽雞胴體菌落總數(shù)Fig.1 Distribution of the total viable bacteria count in yellow feather chicken carcass

2.2 加工環(huán)境表面菌數(shù)變化

本試驗(yàn)選擇凈膛工人手套、預(yù)冷槽內(nèi)表面和內(nèi)角、分級(jí)車間臺(tái)面及分級(jí)車間工人手套為取樣對(duì)象，分析其總菌數(shù)分布情況，結(jié)果如圖2。由圖2 可知，所有接觸表面中預(yù)冷池內(nèi)角總菌數(shù)最高，為5.42 lg（CFU/cm2）；分級(jí)秤表面次之為4.85 lg（CFU/cm2）；預(yù)冷槽內(nèi)角、凈膛工人手套、分級(jí)車間工人手套分別高達(dá)4.56、4.39、4.06 lg（CFU/cm2）。由此可知，凈膛工人手套、預(yù)冷槽、分級(jí)秤及分級(jí)車間工人手套成為影響黃羽雞總菌數(shù)變化在凈膛、預(yù)冷及分級(jí)篩選后工藝點(diǎn)主要的污染源。

圖2 設(shè)備表面菌落總數(shù)分布Fig.2 Distribution of the total viable bacteria counts in the equipment surface

2.3 Alpha 多樣性指數(shù)分析結(jié)果

Alpha 多樣性指數(shù)是指特定環(huán)境內(nèi)多樣性，主要由Chao1、Observed_species、PD_whole_tree 及Shannon 反應(yīng)物種豐度、均勻度以及測(cè)序深度[19-20]。由圖3 可知，分級(jí)秤的表面（BC）的Chao1、Shannon 指數(shù)高于其他組，再次說(shuō)明分級(jí)秤表面菌群豐度和多樣性是各工藝點(diǎn)最高。這一結(jié)果與成品菌相豐度和多樣性相一致。

圖3 菌群Alpha 多樣性指數(shù)箱圖Fig.3 Box plots for alpha diversity indexes of microflora

2.4 菌群分布聚類分析

2.4.1 基于科分類水平的分析 由圖4 可知，打毛后（DM）、凈膛后（JH）、凈膛消毒后（CH）黃羽雞胴體優(yōu)勢(shì)菌主要為鏈球菌科（Streptococcaceae），腸桿菌科（Enterobacteriaceae）次之，氣單胞菌科（Aeromonadaceae）僅次于腸桿菌科。凈膛后經(jīng)瞬時(shí)清洗消毒后腸桿菌科所占比例大幅下降。黃羽雞經(jīng)預(yù)冷槽預(yù)冷后氣單胞菌科豐度大幅增加。說(shuō)明預(yù)冷槽中環(huán)境溫度及其他條件更適宜于氣單胞菌科生長(zhǎng)。進(jìn)入電解水減菌槽后，氣單胞菌科和鏈球菌科豐度大幅下降，說(shuō)明次氯酸對(duì)這兩類菌具有較好抑制作用。莫拉氏菌科（Moraxellaceae）成為黃羽雞減菌后的優(yōu)勢(shì)菌群，氣單胞菌科次之。經(jīng)過(guò)分級(jí)秤分級(jí)后黃羽雞胴體菌群中莫拉氏菌科豐度再次增加，說(shuō)明分級(jí)秤表面污染優(yōu)勢(shì)菌群主要是莫拉氏菌科。并通過(guò)對(duì)分級(jí)秤表面菌群多樣性的分析，也證實(shí)分級(jí)秤表面的優(yōu)勢(shì)菌主要為莫拉氏菌科?；谝陨峡茖俜治觯涝走^(guò)程微生物控制需關(guān)注不同科屬菌類特性，控制屠宰條件定向消減微生物。

圖4 基于科水平的物種組成分析柱狀圖Fig.4 Bacterial community distribution at the family level

2.4.2 基于屬分類水平的分析 熱圖通過(guò)不同顏色深淺的變化來(lái)反映二維矩陣或表格中的原始數(shù)據(jù)信息[19]，如圖5 所示，屠宰7 個(gè)工藝點(diǎn)黃羽雞胴體菌群多樣性以及分級(jí)秤表面和預(yù)冷池內(nèi)部菌群多樣性結(jié)果。打毛后（DM）、凈膛消毒后（CH）、預(yù)冷后（YH）、電解水處理后（DH）黃羽雞胴體優(yōu)勢(shì)菌主要為鏈球菌屬，大腸桿菌屬、氣單胞菌屬。分級(jí)秤的表面（BC）、分級(jí)車間臺(tái)面（BZ）優(yōu)勢(shì)菌主要為不動(dòng)桿菌屬、巨球菌屬和嗜冷桿菌屬。

圖5 菌屬分類學(xué)熱圖Fig.5 Taxonomy heat map of bacteria

由圖6 可知，打毛后（DM）、凈膛后（JH）、凈膛消毒后（CH）黃羽雞胴體優(yōu)勢(shì)菌主要為鏈球菌屬（Streptococcus），大腸桿菌屬（Escherichia）和氣單胞菌屬（Aeromonas）次之。凈膛后經(jīng)瞬時(shí)清洗消毒對(duì)大腸桿菌科減菌效果顯著。黃羽雞經(jīng)預(yù)冷槽預(yù)冷后氣單胞菌屬豐度大幅增加，鏈球菌屬次之。經(jīng)額外添加次氯酸電解水減菌后，氣單胞菌屬和鏈球菌屬豐度大幅下降，說(shuō)明次氯酸電解水減菌效果較好。經(jīng)過(guò)分級(jí)秤分級(jí)后黃羽雞胴體菌群中不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）成為主要優(yōu)勢(shì)菌，巨球菌屬（Macrococcus）次之。并通過(guò)對(duì)分級(jí)秤表面菌群多樣性的分析，也證實(shí)分級(jí)秤表面的優(yōu)勢(shì)菌主要為不動(dòng)桿菌屬、巨球菌屬和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）。以上檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，分級(jí)過(guò)程需針對(duì)性控制接觸面微生物，目前黃羽肉雞屠宰減菌技術(shù)主要依賴預(yù)冷環(huán)節(jié)次氯酸電解水進(jìn)行減菌，需針對(duì)性研究附加減菌環(huán)節(jié)及屠宰分級(jí)過(guò)程接觸面衛(wèi)生控制方法。

圖6 基于屬水平的物種組成分析柱狀圖Fig.6 Bacterial community distribution at the genus level

3 討論

微生物是導(dǎo)致雞肉腐敗的主要因素。肉雞在屠宰加工的過(guò)程中所接觸的各個(gè)表面都將可能成為肉雞胴體的污染源。因此，通過(guò)分析肉雞胴體屠宰過(guò)程中所接觸的各個(gè)表面的微生物菌群結(jié)構(gòu)，從而為企業(yè)中雞肉的保鮮防腐提供理論基礎(chǔ)是非常必要的。肉雞胴體、處理水和設(shè)備之間的交叉污染會(huì)增加肉雞胴體的微生物污染水平[21]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明分級(jí)秤的表面（BC）的微生物的豐富度最高，這主要因?yàn)榉旨?jí)稱會(huì)接觸到不同的肉雞胴體，這大大增加了雞肉上微生物相互污染的機(jī)會(huì)；預(yù)冷池內(nèi)表面（YB）和預(yù)冷池內(nèi)角（YJ）的微生物生物的豐富度較低，這主要原因是屠宰預(yù)冷水中通常會(huì)加入一定含量的次氯酸電解水，這對(duì)微生物會(huì)有殺滅作用，可以有效地減少微生物的菌群數(shù)量，降低微生物的物種豐富度，抑制雞肉胴體上腐敗菌的生長(zhǎng)[22]，黃羽雞經(jīng)預(yù)冷槽預(yù)冷后氣單胞菌科豐度大幅增加，說(shuō)明預(yù)冷槽中環(huán)境溫度及其他條件更適宜于氣單胞菌科生長(zhǎng)；凈膛操作會(huì)增加微生物污染，這可能是因?yàn)閮籼胚^(guò)程存在外源操作及腸道菌群污染的幾率在凈膛后經(jīng)瞬時(shí)清洗消毒后腸桿菌科所占比例大幅下降。本試驗(yàn)測(cè)試了次氯酸電解水在屠宰后對(duì)黃羽肉雞雞胴體減菌效果，試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)額外添加次氯酸電解水減菌后，氣單胞菌屬和鏈球菌屬豐度大幅下降，說(shuō)明次氯酸電解水減菌效果較好。任晉東等[23]報(bào)道消毒劑可以顯著地抑制雞肉上腐敗菌的生長(zhǎng)，并不對(duì)雞肉的感官品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響。韓千慧等[24]報(bào)道酸性電解水能有效地降低醬鹵鴨制品在冷涼及貯藏過(guò)程中的微生物的數(shù)量。針對(duì)以上從屬的水平上看，鏈球菌屬（Streptococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）等是肉雞胴體在各個(gè)不同處理環(huán)節(jié)中都會(huì)存在的菌種。戴寶玲等[3]報(bào)道通過(guò)高通測(cè)序發(fā)現(xiàn)雞肉屠宰場(chǎng)空氣中含有不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和埃希菌屬（Escherichia）等菌屬。桂國(guó)弘等[25]報(bào)道雞肉的儲(chǔ)藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、大腸桿菌屬（Escherichia），本研究結(jié)果與之相類似。

4 結(jié)論

綜合本試驗(yàn)研究結(jié)果，凈膛、預(yù)冷及分級(jí)篩選工序是黃羽肉雞菌數(shù)增長(zhǎng)的主要污染來(lái)源工序，分級(jí)秤、分級(jí)車間工人手套、預(yù)冷槽及凈膛工人手套為以上三個(gè)工序中污染來(lái)源接觸面，且分級(jí)秤及分級(jí)車間工人手套所污染菌群是黃羽雞胴體菌群的主要來(lái)源，促使黃羽雞胴體表面總菌數(shù)增長(zhǎng)率高達(dá)24.13%，經(jīng)過(guò)分級(jí)秤及分級(jí)車間工人手后黃羽雞菌落總數(shù)顯著增加至4.63 lg（CFU/g）（P＜0.05），黃羽肉雞屠宰企業(yè)在屠宰過(guò)程中需關(guān)注以上三個(gè)工序衛(wèi)生操作及接觸面微生物控制，對(duì)分級(jí)秤、分級(jí)車間工人手套、預(yù)冷槽及凈膛工人手套進(jìn)行定期消毒將有助于黃羽雞生鮮肉制品的保鮮和貯藏。打毛后（DM）、凈膛后（JH）、凈膛消毒后（CH）黃羽雞胴體優(yōu)勢(shì)菌主要為鏈球菌屬（Streptococcus），大腸桿菌屬（Escherichia）和氣單胞菌屬（Aeromonas）次之。凈膛后經(jīng)瞬時(shí)清洗消毒對(duì)大腸桿菌科減菌效果顯著。黃羽雞經(jīng)預(yù)冷槽預(yù)冷后氣單胞菌屬豐度大幅增加，鏈球菌屬次之。經(jīng)過(guò)分級(jí)秤分級(jí)后黃羽雞胴體菌群中不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）為主要優(yōu)勢(shì)菌，巨球菌屬（Macrococcus）次之。額外添加次氯酸電解水減菌后，黃羽肉雞胴體表明氣單胞菌屬和鏈球菌屬豐度大幅下降，說(shuō)明次氯酸電解水減菌效果較好。本試驗(yàn)通過(guò)微生物分析發(fā)現(xiàn)了黃羽肉雞屠宰過(guò)程中的主要污染源及不同環(huán)節(jié)微生物優(yōu)勢(shì)菌屬，并證明次氯酸電解水有良好的殺菌效果，未針對(duì)性研究不同菌屬減菌方法，也未能找到在分級(jí)挑選后集成流水線殺菌方法，后續(xù)相關(guān)研究工作者需關(guān)注屠宰工藝優(yōu)化及關(guān)鍵污染環(huán)節(jié)殺菌集成方法，繼續(xù)提升黃羽肉雞屠宰水平。