趙紫燕 呂彩霞

【摘要】艾滋病病毒是一種人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV），檢測(cè)HIV病毒感染對(duì)艾滋病的預(yù)防和治療具有重要意義。目前，廣泛采用的檢測(cè)方法有膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金免疫層析法（GICA）和核酸擴(kuò)增試驗(yàn)等。本文介紹了艾滋病病毒臨床癥狀以及對(duì)這幾種艾滋病病毒感染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法進(jìn)行探討。

【關(guān)鍵詞】艾滋?。徊《靖腥?；實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

Study on experimental detection methods of AIDS virus infection

ZHAO Ziyan， LV Caixia

Disease Prevention and Control Center of Yuzhong County， Lanzhou City， Gansu， Lanzhou， Gansu 703100， China

【Abstract】AIDS virus is a kind of human immunodeficiency virus （HIV），the detection of HIV infection is of great significance for the prevention and treatment of AIDS.The widely used detection methods currently included colloidal gold assay，enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA），gold immunochromatographic assay （GICA）and nucleic acid amplification assay.This article introduced the clinical symptoms of AIDS virus and discusses the experimental detection methods of these AIDS virus infections.

【Key Words】AIDS； Viral infection； Experimental detection

HIV是一種人類(lèi)免疫缺陷病毒，是導(dǎo)致人類(lèi)免疫系統(tǒng)疾病的主要原因。艾滋病病毒通過(guò)破壞人體的免疫系統(tǒng)，引起多種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤，導(dǎo)致患者死亡。目前，艾滋病病毒主要的檢測(cè)方法比較常見(jiàn)的方法有核酸擴(kuò)增試驗(yàn)、膠體金法和ELISA法。

1 HIV的主要臨床表現(xiàn)

艾滋病的主要臨床表現(xiàn)是持續(xù)的、進(jìn)行性加重的淋巴結(jié)腫大，并伴有持續(xù)性發(fā)熱、腹瀉、體重下降，部分患者還可出現(xiàn)肝脾腫大，口腔黏膜出現(xiàn)白念珠菌感染以及神經(jīng)系統(tǒng)的損害等。艾滋病病毒感染者在感染后潛伏期平均為8～10年，在潛伏期內(nèi)沒(méi)有任何臨床癥狀，具有很強(qiáng)的隱蔽性，當(dāng)感染者在疾病晚期出現(xiàn)一些非特異性癥狀時(shí)往往已經(jīng)處于疾病的終末期。

HIV感染早期主要是上呼吸道感染、發(fā)熱、乏力、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，有的感染者也可能沒(méi)有任何癥狀。隨著疾病的進(jìn)展，感染者會(huì)逐漸出現(xiàn)以下表現(xiàn)：急性感染期：艾滋病病毒感染后2～4周出現(xiàn)，平均潛伏期為8～12周，表現(xiàn)為低熱、咽痛、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)疼痛等上呼吸道感染癥狀；無(wú)癥狀潛伏期：有過(guò)高危性行為者，在此階段后，一般人群可無(wú)任何癥狀地度過(guò)潛伏期后進(jìn)入急性期；艾滋病期：平均潛伏期為6～10年，此階段可出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)，如持續(xù)性全身淋巴結(jié)腫大[1]。

艾滋病病毒感染者可以有多種途徑排毒。體內(nèi)HIV濃度可達(dá)數(shù)萬(wàn)個(gè)/mL以上，主要通過(guò)以下途徑排出體外：血液途徑：如靜脈注射；性接觸途徑：如與HIV感染者進(jìn)行無(wú)保護(hù)性行為；母嬰途徑：如母親為HIV感染者所生的孩子。艾滋病病毒感染的機(jī)會(huì)并不是絕對(duì)的，受感染的時(shí)間和機(jī)體免疫力、感染部位的不同等因素影響，艾滋病病毒感染者在未發(fā)病之前其體內(nèi)HIV濃度會(huì)比較高。據(jù)報(bào)道艾滋病病毒感染者在發(fā)病前有1～4年的潛伏期[2]。

2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是根據(jù)抗原和抗體特異性結(jié)合反應(yīng)而設(shè)計(jì)的一種實(shí)驗(yàn)方法。通過(guò)酶標(biāo)記的抗體與抗原特異性結(jié)合，在酶的催化下，將底物顯色，并通過(guò)一定的計(jì)算公式，判定是否出現(xiàn)顏色變化，從而判斷被檢樣品中是否含有HIV病毒抗體。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是檢測(cè)HIV抗體常用的方法，其原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合反應(yīng)而設(shè)計(jì)的。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。該方法檢測(cè)標(biāo)本中HIV病毒載量常用的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和免疫印跡法（WB）。其中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是最早應(yīng)用于臨床檢測(cè)HIV抗體的一種方法，是目前臨床檢測(cè)HIV抗體常用的方法之一[3]。該方法以抗原或抗體為包被抗原，加入待測(cè)標(biāo)本中，加入酶標(biāo)記的抗體，通過(guò)酶促反應(yīng)使抗原與抗體發(fā)生反應(yīng)。其缺點(diǎn)是對(duì)樣本中HIV病毒載量要求較高，并且對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)人員要求也比較高。目前，ELISA主要用于對(duì)血液標(biāo)本中HIV病毒載量的檢測(cè)。

3 膠體金法

膠體金是一種非放射性的新型標(biāo)記物質(zhì)，它與蛋白質(zhì)結(jié)合，就會(huì)使其在膠體金顆粒表面呈現(xiàn)出紅色的熒光，這種熒光主要是由于膠體金顆粒上的金離子螯合了蛋白質(zhì)分子上的巰基，使蛋白質(zhì)分子攜帶了電子，從而使其帶有正電荷。這種性質(zhì)使得膠體金能夠與蛋白結(jié)合，也能夠被酶所催化。目前，膠體金檢測(cè)法是一種快速、便捷、靈敏度高的檢測(cè)方法。尤其是在對(duì)HIV進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，使用這種方法能有效地避免傳統(tǒng)檢測(cè)方法中易出現(xiàn)的假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果，其靈敏度可達(dá)1：10000。

HIV膠體金診斷試劑采用膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫印跡技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜，而且操作時(shí)間短，僅需15～20min就能完成檢測(cè)過(guò)程。其缺點(diǎn)是：第一，檢測(cè)窗口期長(zhǎng)達(dá)1～3個(gè)月；第二，在樣本收集、保存過(guò)程中容易出現(xiàn)污染的情況；第三，由于HIV是一種免疫復(fù)合物病毒，所以在臨床上存在一定的假陰性結(jié)果；第四，在對(duì)HIV進(jìn)行檢測(cè)時(shí)存在一定的誤差[4]。

4 膠體金免疫層析法（GICA）

膠體金免疫層析法是將膠體金標(biāo)記的抗體與待檢測(cè)樣品抗原或抗體結(jié)合，利用膠體金的特異特性，采用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于臨床急性期的篩查。免疫層析技術(shù)是基于膠體金標(biāo)記抗體（或抗原），利用膠體金顆粒良好的特異性吸附能力和敏感性高，能夠?qū)乖蚩贵w進(jìn)行快速檢測(cè)的一種技術(shù)。免疫層析技術(shù)是將包被有多個(gè)抗體標(biāo)記物的膠體金顆粒，通過(guò)試紙條（一種可在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的儀器）和被檢樣品中抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，以達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

免疫層析技術(shù)主要是利用膠體金標(biāo)記抗體（或抗原）和被檢物抗原或抗體特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。其特異性取決于被檢物是否含有與之結(jié)合的抗體（或抗原）。免疫層析技術(shù)可以用于血液、尿液、唾液等樣品中抗原或抗體檢測(cè)，也可以用于各種慢性疾病的診斷和早期臨床觀察。膠體金免疫層析技術(shù)具有快速、靈敏、特異及簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，因此，免疫層析技術(shù)已成為臨床醫(yī)學(xué)診斷中一種常用的診斷手段[5]。

現(xiàn)在，我國(guó)對(duì)于艾滋病的檢測(cè)主要使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和膠體金免疫層析技術(shù)。ELISA雖然操作比較簡(jiǎn)單、便捷、快速、準(zhǔn)確，但是由于這種方法比較繁瑣、復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，因此在實(shí)際操作中較難應(yīng)用。而相對(duì)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，膠體金免疫層析技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確性高、耗時(shí)短，但是也存在著一定的局限性：第一是該方法不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；第二是該方法需要大量的樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；第三是該方法對(duì)樣本要求較高，并且所需樣本過(guò)多時(shí)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)效率；第四是該方法對(duì)樣本具有一定的依賴性。

5 核酸擴(kuò)增試驗(yàn)

利用逆轉(zhuǎn)錄酶，HIV可以利用宿主細(xì)胞的基因組RNA，來(lái)合成自身的病毒。核酸擴(kuò)增試驗(yàn)是一種常用的HIV檢測(cè)方法。該方法是在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)方法。該方法可用于HIV的初步診斷和追蹤隨訪，也可用于實(shí)驗(yàn)室和臨床樣本的檢測(cè)，適用于基層和邊遠(yuǎn)地區(qū)醫(yī)院和血站進(jìn)行篩查檢測(cè)。

5.1 原理 核酸擴(kuò)增試驗(yàn)是通過(guò)使用引物和探針，將引物與模板DNA序列特異結(jié)合，然后使用含有不同引物的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交后，觀察雜交結(jié)果。此方法主要用于HIV病毒的檢測(cè)。

HIV病毒是一種嗜細(xì)胞性病毒，只有在CD4+T淋巴細(xì)胞存在的情況下才能復(fù)制。由于HIV病毒不能在體外培養(yǎng)，因此HIV病毒感染必須從感染者的體液或組織中提取核酸來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

5.2檢測(cè)步驟

（1）準(zhǔn)備樣本：從采血初篩的HIV感染者中，采集至少5個(gè)病毒血癥患者（血液或血漿）的血液或組織樣本。使用抗凝管采集血液樣本，采集血液前要在手臂上進(jìn)行靜脈采血。（2）標(biāo)本處理：用無(wú)菌紗布擦干手臂上的液體，然后將采血后的血液和組織樣本置于-70℃冰箱內(nèi)保存，或者在室溫下儲(chǔ)存。為保證血液的質(zhì)量，使用前要將血細(xì)胞和血漿分離出來(lái)。（3）加入試劑：用移液器加入病毒核酸擴(kuò)增試驗(yàn)所需的所有試劑。（4）上機(jī)檢測(cè)：將處理后的標(biāo)本和試劑盒一起加入PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷是否存在HIV病毒。

5.3病毒核酸擴(kuò)增試驗(yàn)

（1）標(biāo)本處理：血細(xì)胞分離出的血漿和組織樣本先用無(wú)菌紗布擦干，再用無(wú)菌棉簽蘸取血液或組織樣本中的血漿，用移液器加入相應(yīng)的試劑盒中，將試劑加入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。（2）檢測(cè)結(jié)果判定：對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判讀，根據(jù)所加試劑盒中所含試劑的具體濃度和種類(lèi)，分別判定為陰性、陽(yáng)性或不確定。（3）復(fù)檢：病毒核酸擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果為陰性或陽(yáng)性的標(biāo)本，在復(fù)檢時(shí)可進(jìn)行復(fù)查，有的標(biāo)本要再次加入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

5.4 HIV抗體檢測(cè)

HIV抗體檢測(cè)包括窗口期的檢測(cè)和早期的確證試驗(yàn)，窗口期的檢測(cè)是指從感染HIV到血液中出現(xiàn)第一次抗體所需的時(shí)間，窗口期越長(zhǎng)，提示感染者可能具有傳染性；早期確證試驗(yàn)是指從感染 HIV到能用實(shí)驗(yàn)室方法確證其是否感染HIV所需的時(shí)間，早期確證試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，即表示有傳染性。根據(jù)檢測(cè)原理不同，HIV抗體檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、熒光定量PCR和化學(xué)發(fā)光法等。不同技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)和適應(yīng)范圍，臨床上根據(jù)需求選擇相應(yīng)的檢測(cè)方法。

5.5 結(jié)果判斷

5.5.1.陰：陰性結(jié)果顯示為綠色熒光。由于PCR法特異性強(qiáng)，一般檢測(cè)陰性結(jié)果不能排除艾滋病的可能。

5.5.2.陽(yáng)：陽(yáng)性結(jié)果判斷，陽(yáng)性反應(yīng)的產(chǎn)物為紅色熒光。病毒核酸擴(kuò)增試驗(yàn)的特異性、靈敏性和敏感性與逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）相當(dāng)。HIV核酸擴(kuò)增試驗(yàn)是目前艾滋病篩查、診斷和治療中最重要的檢測(cè)方法之一。廣泛應(yīng)用于艾滋病患者的診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)防宣傳教育工作中。

6 結(jié)語(yǔ)

艾滋病是一種危害性極大的傳染病，目前尚無(wú)有效的治療方法，但可通過(guò)預(yù)防控制措施降低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)的艾滋病檢測(cè)仍處于起步階段，檢測(cè)試劑和儀器與發(fā)達(dá)國(guó)家相比仍存在較大差距，導(dǎo)致我國(guó)艾滋病感染率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康。檢測(cè)艾滋病病毒抗體，在艾滋病感染者發(fā)病早期就能發(fā)現(xiàn)并及時(shí)采取預(yù)防措施，就能有效地控制艾滋病的流行。

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