徐 朗,趙梓彭,謝 冰,郭 暢,張睿捷,王曉娜

(河北農業(yè)大學園林與旅游學院,河北 保定 071000)

【研究意義】白皮松(Pinusbungeana)皮色獨特、四季常青,極具觀賞價值。但白皮松的耐鹽性較弱,觀賞與經(jīng)濟價值受到極大影響[1]。有研究表明,植物根際或根內的微生物能同植物形成互惠共生的協(xié)作方式,提高植物對環(huán)境的適應性[2-3]。深色有隔內生真菌(DSE)是一類利于植物生長發(fā)育的內生真菌,分布廣泛且非專性寄生。因此,研究鹽環(huán)境下DSE真菌對白皮松生長發(fā)育的影響,對提高白皮松觀賞與經(jīng)濟價值具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】鹽脅迫下,細胞內過高的鹽分含量對植物有毒害作用,Na+的過度積累會引發(fā)許多次生效應,如生長受限,抑制葉片的光合作用和蒸騰作用等[4-6]。K+和Na+結合的轉運系統(tǒng)是植物耐鹽性的關鍵決定因素[7]。Na+會與K+競爭結合根系細胞位點和轉運蛋白,繼而在植物體內易位、沉積和分區(qū)。一旦細胞儲存鹽的能力耗盡,鹽分就會在細胞間隙積聚,從而導致細胞脫水和死亡[8]。當前DSE真菌已被發(fā)現(xiàn)對提高植物耐鹽能力具有重要作用。Pan等[9]從分離自堿蓬(Suaedasalsa)的Curvulariasp.菌株可以通過提高毛白楊(Populustomentosa)的SOD和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性,增加葉綠素和脯氨酸含量,減輕鹽脅迫對毛白楊的不利影響。魏苗[10]將分離自黑枸杞(Lyciumruthenicum)根部的DSE真菌回接于黑枸杞植株,可以改善鹽環(huán)境中黑枸杞的生理指標,提高地下與地上生物量,提高根體積根面積等,降低鈉離子對黑枸杞的毒害。鄧勛等[11-12]發(fā)現(xiàn),將Phialocephalahelvetica回接于樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)植株有助于提高葉綠素含量,增強光合作用效率,進而促進寄主生物量的積累。除此之外,Hou等[13]研究發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫處理下,接種DSE菌株會影響油蒿(Artemisiaordosica)根際土壤微生境,增加根際微生物豐度,有助于提高植物在鹽堿環(huán)境下的生態(tài)適應性?！颈狙芯壳腥朦c】當前白皮松的研究主要集中在天然林地的分布規(guī)律[14-15]、群落特征及其多樣性[16]、白皮松種實性狀[17-18]、白皮松生物量、碳氮分配[19]等,而對提高白皮松的耐鹽性[1,20]的研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以白皮松為材料,通過菌株回接盆栽試驗,研究DSE菌株對白皮松的生長、光合熒光和K+、Na+離子含量的影響,探究DSE對提高白皮松耐鹽性的影響,同時為生物技術修復鹽漬化土壤提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 土壤基質

由保定農田土與洗凈的河沙組成,分別過2 mm 篩后,以沙土比 3∶2(v/v)混勻,再經(jīng)過高溫高壓滅菌處理(121 ℃,0.1 Mpa,2 h)備用。

1.2 供試植物與菌種

供試白皮松無菌苗:于2021年5月,在智能溫室中。挑選果實飽滿、顆粒均勻的白皮松種子,滅菌處理后放入70 ℃無菌溫水中浸泡進行催芽處理,24 h換水1次。待種殼出現(xiàn)裂口,挑選并轉移種子于75%酒精滅菌的裝有培養(yǎng)基質的穴盤中,每穴2粒,培育期間僅以無菌水灌溉。

供試菌種為分離自白皮松根系的4株DSE真菌:Paraphomaradicina(Pr),Phialophoramustea(Pm),Alternariatenuissima(At),Acrocalymmavagum(Av)。

1.3 試驗設計

試驗包括NaCl脅迫和接種處理,其中NaCl脅迫設置4個濃度水平:0%、0.1%、0.2%、0.3% ;分別接種P.radicina(Pr),P.mustea(Pm),A.tenuissima(At),A.vagum(Av)和未接種對照(CK)組,每個處理3個重復。2022年6月取1.5 kg混合基質加入滅菌種植袋(75 %酒精滅菌)中,將2個直徑9 mm接種了DSE的PDA菌餅(約20 g)放置于基質上層,CK組則加入2個未接菌的PDA培養(yǎng)基,其上種植苗齡1年(高約6 cm)且長勢一致的白皮松幼苗,每盆4株,然后覆填1.5 kg混合基質進行培養(yǎng),無菌水灌溉。待幼苗生長1個月后,隨機挑選白皮松幼苗觀測侵染情況,確定菌株侵染白皮松幼苗后,進行NaCl脅迫處理。為避免鹽激處理,每隔1 d增加50 mL 0.34 mol/L NaCl,直至達到預定脅迫濃度[21]。脅迫第30天測定光合熒光參數(shù),次日收獲以測定其他相關指標。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 侵染率測定 根據(jù)陳思杰[22]觀察枸杞根系深色有隔內生真菌侵染的方法,以臺盼藍為染色液進行染色,顯微鏡觀察并統(tǒng)計DSE的定殖率。

1.4.2 生物量測定 每個處理選取3株幼苗,分為地上和地下兩部分,清水洗去土壤后控干水分,105 ℃殺青后于80 ℃烘干直至恒重,測量各部分平均生物量。

1.4.3 光合熒光參數(shù)測定 參考李得孝[23]的方法測定總葉綠素含量;采用LI-6400便攜式光合測定儀(美國 Li-COR公司)于上午9:00—12:00,選取長勢一致的葉片測定光合參數(shù)。測定葉綠素熒光參數(shù)使用FluorPen手持式葉綠素熒光儀(PSI,捷克),測量前用葉夾進行30 min暗適應。

1.4.4 礦質營養(yǎng)測定 采用濕消化法測定K+和Na+的含量[24]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,使用 Duncan法檢驗不同處理組均值的差異(P<0.05),利用 Excel 2020進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對白皮松DSE侵染率的影響

NaCl脅迫處理30 d后對白皮松幼苗根系組織進行顯微觀測,分析各菌株侵染率。如圖1所示,隨著NaCl脅迫的增加,Pr菌株的侵染率呈上升趨勢;Pm和Av菌株的侵染率呈先上升后下降趨勢,在0.2% NaCl濃度達到最高,分別為75%、71.7%;At菌株的侵染率在0.1% NaCl濃度下最高,為72.7%。結果表明,適度的NaCl脅迫可促進侵染率的提高。

不同小寫字母表示菌種處理間差異顯著(P<0.05)。0.0%, 0.1%, 0.2%和0.3 %表示不同的NaCl濃度。下同。Different small letters above the error bars indicate significant difference among the inoculation treatments(P <0.05). 0.0%, 0.1%, 0.2% and 0.3% indicate different NaCl concentrations. The same as below.

2.2 接種DSE對NaCl脅迫下白皮松生物量的影響

如圖2所示,隨著NaCl脅迫的增加,白皮松生物量總體隨鹽濃度的增加而呈下降趨勢。對比CK處理,在0% NaCl濃度下,接種Pr、Pm、Av菌株的白皮松地上、地下及總生物量顯著高于CK。在0.1% NaCl濃度下,接菌白皮松地上生物量均顯著提高;而接種Av菌株的白皮松地下和總生物量顯著高于CK組白皮松。在0.2% NaCl濃度下,接種Pr、Av菌株對幼苗地上生物量提高顯著,分別提高17.6%、18.0%;接種Pr菌株的白皮松地下和總生物量顯著提高。而在0.3% NaCl濃度下,接種Pr、Pm、At、Av菌株的白皮松地上生物量分別提高76.0%、38.8%、36.5%、51.3%,地下生物量分別提高28.5%、45.9%、29.7%、44.5%,總生物量分別提高66.7%、41.3%、34.1%、48.9%。

圖2 NaCl脅迫下接種DSE對白皮松生物量的影響Fig.2 Effects of DSEs inoculation on biomass of P. bungeana under NaCl stress

2.3 接種DSE對NaCl脅迫下白皮松總葉綠素含量的影響

如圖3所示,NaCl脅迫降低了白皮松總葉綠素含量。接菌處理可緩解脅迫下白皮松總葉綠素含量的降低。在0% NaCl濃度下,接菌白皮松葉綠素含量顯著高于CK組;在0.1% NaCl濃度下,接種Pr菌株葉綠素含量是CK組的1.27倍,其余接菌處理白皮松葉綠素含量無顯著變化;在0.2%和0.3% NaCl濃度下,接種菌白皮松葉綠素含量均顯著高于CK組。

圖3 NaCl脅迫下接種DSE對白皮松總葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of DSEs inoculation on total chlorophyll content of P. bungeana under NaCl stress

2.4 接種DSE對NaCl脅迫下白皮松光合參數(shù)的影響

如圖4所示,NaCl脅迫使白皮松各項參數(shù)明顯降低。對比CK組,在0% NaCl濃度下,接菌白皮松凈光合速率提高;接種Pr、Pm、At菌株提高白皮松的氣孔導度,分別是CK組的1.9、1.64、2.8倍;接種Pr菌株白皮松的蒸騰速率低于CK組,其余處理無顯著變化。在0.1% NaCl濃度下,接菌白皮松凈光合速率、氣孔導度均顯著高于CK組;接種Pr菌株的蒸騰速率出現(xiàn)降低,而Pm、At菌株蒸騰速率高于CK組。在0.2% NaCl濃度下,接種Pr、Av菌株的白皮松凈光合速率和氣孔導度均高于CK組,蒸騰速率各接菌處理無顯著變化。0.3% NaCl濃度下,接菌處理凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率均大于CK組。

圖4 NaCl脅迫下接種DSE對白皮松光合參數(shù) Pn、Gs、Tr、Ci的影響Fig.4 Effects of DSEs inoculation on photosynthetic parameters Pn,Gs,Tr and Ciof P. bungeana under NaCl stress

對于白皮松胞間CO2濃度,在0%和0.1% NaCl濃度下接種Av菌株白皮松低于其余組;在0.2% 和0.3% NaCl濃度下,接菌處理胞間CO2濃度均顯著高于CK組。

2.5 接種DSE對NaCl脅迫下白皮松葉綠素熒光參數(shù)的影響

ABS/RC表示單位PSII中反應中心吸收的光能。如表1所示,在0%和0.1% NaCl濃度下,CK組ABS/RC值均高于接菌白皮松;在0.2% NaCl濃度下,相較于CK組,接種Pr、Pm、Av菌株的白皮松ABS/RC值分別降低25%、11%、35%;在0.3% NaCl濃度下,未接菌白皮松ABS/RC值進一步提高,達到9.86。

表1 NaCl脅迫下接種DSE對白皮松葉綠素熒光參數(shù)的影響

TRo/RC指單位反應中心捕獲的用于還原 QA的光能。隨著NaCl脅迫增強,接種Pr、Pm、Av菌株的白皮松TRo/RC值整體上呈上升趨勢。CK組和接種At菌株的白皮松TRo/RC值呈先上升后下降趨勢,分別在0.1%和0.2% NaCl濃度達到最高值,分別為2.02和2.13。

ETo/RC是指單位反應中心捕獲的用于電子傳遞的光能。在0% NaCl濃度下,CK組ETo/RC值是接種At菌株的1.14倍,而與其他接菌處理無顯著差異;在0.1% NaCl濃度下,CK組ETo/RC值均高于接菌白皮松;在0.2% NaCl濃度下,接種白皮松ETo/RC值相比CK組差異不顯著;在0.3% NaCl濃度下,接種Pr、Pm、Av菌株的白皮松ETo/RC值顯著高于CK組。

DIo/RC是單位反應中心耗散掉的能量。NaCl脅迫增加使得白皮松DIo/RC值均呈升高趨勢。在0%和0.1% NaCl濃度下,CK組DIo/RC值均高于接菌白皮松;在0.2% NaCl濃度下,CK組DIo/RC值分別是接種Pr、Pm、Av菌株白皮松的1.9、1.2、2.07倍,但與接種At菌株的白皮松無顯著差異;在0.3% NaCl濃度下,CK組DIo/RC值分別是接菌白皮松的7.42、6.81、4.69、7.29。

2.6 接種DSE對NaCl脅迫下白皮松離子含量的影響

2.6.1 對Na+含量的影響 由圖5可知,白皮松地上部分Na+含量在0% NaCl濃度下,除接種Pr菌株顯著高于CK組外,其余處理無顯著差異。在0.1% NaCl濃度,接菌處理白皮松地上部分Na+含量均高于CK組;在0.2% NaCl濃度下,接種Av菌株的地上部分白皮松Na+含量顯著低于CK組;在0.3% NaCl濃度下,接種Pm、At、Av菌株的白皮松地上部分Na+含量顯著降低,分別下降34.0%、26.6%、26.3%。在0.3% NaCl濃度下,接種Pm、Av菌株的白皮松地下部分Na+含量顯著低于CK組,分別下降24.4%和26.6%,其余NaCl濃度接菌與CK組Na+含量無顯著差異。

圖5 NaCl脅迫下接種DSE對白皮松Na+含量的影響Fig.5 Effects of DSEs inoculation on Na+content of P. bungeana under NaCl stress

2.6.2 對K+含量的影響 如圖6所示,白皮松地上部分K+含量,除0.1% NaCl濃度下,接種Pr菌株的白皮松K+含量顯著高于CK組外,其余處理均無顯著差異。在0.2% NaCl濃度下,接菌處理的白皮松地下部分出現(xiàn)顯著提高,分別增加42.9%、58.99%、56.96%、55.92%;在0.3% NaCl濃度下,接菌白皮松K+含量高于CK組,其中接種At菌株差異顯著。

圖6 NaCl脅迫下接種DSE對白皮松K+含量的影響Fig.6 Effects of DSEs inoculation on K+ content of P. bungeana under NaCl stress

2.6.3 對K+/Na+比的影響 由圖7可知,在0%和0.1% NaCl濃度下,CK組白皮松地上部分K+/Na+比值高于接菌白皮松;但在0.2% NaCl濃度下,接種Pr、Pm、Av菌株的白皮松K+/Na+比值相較于CK組有所提高,但變化不顯著;在0.3% NaCl濃度下,接種Pm、At、Av菌株的白皮松K+/Na+比值高于CK組,分別提高64.2%、35.3%、21.8%。在0% NaCl濃度下接種At菌株白皮松K+/Na+比值顯著高于CK組,提高31.8%;在0.1% NaCl濃度下,接菌處理與CK組無顯著差異;在0.2% NaCl濃度下,接菌處理K+/Na+比值均顯著高于CK組,分別提高77.5%、67%、60.3%、70.2%;在0.3% NaCl濃度下,接菌處理K+/Na+比值高于CK組,其中接種Pm和Av菌株顯著提高。

圖7 NaCl脅迫下接種DSE對白皮松K+/Na+比含量的影響Fig.7 Effects of DSEs inoculation on K+/Na+ of P. bungeana under NaCl stress

3 討 論

3.1 接種DSE對NaCl脅迫下白皮松生長的影響

DSE真菌能在多樣的環(huán)境中同植物形成共生關系,魏苗[10]對鹽脅迫下黑枸杞DSE真菌資源的耐鹽性研究中發(fā)現(xiàn),在9 g/kg NaCl處理組的DSE定殖率顯著高于3和6 g/kg NaCl處理組,DSE真菌微菌核和菌絲中產(chǎn)生的黑色素、糖原、蛋白質等物質能提高菌絲的萌發(fā)和生長,有利于幫助寄主提高抗逆性。本研究中取得了一致的結果,隨著鹽脅迫增強,DSE菌株的侵染率顯著提高,說明適度的脅迫有助于提高DSE菌株侵染率。

DSE真菌對寄主抗逆性提高的直接作用即體現(xiàn)在對寄主植物生物量的影響。石志剛等[25]發(fā)現(xiàn)LBF-2和LBF-27 DSE真菌的‘寧杞1號’枸杞相較于對照組果實重量提高10.53%～24.56%。劉加強等[26]發(fā)現(xiàn)接種高粱細基格孢菌(Ulocladiumsorghi)的玉米能顯著增加地下干質量,而在5、10 mg/kg Cd質量濃度下,叢赤殼菌(Neonectriaradicicola)和根異莖點霉菌(Phomaradicina)的玉米地上干質量有顯著提升。在本研究中鹽脅迫使得白皮松生物量整體均呈下降趨勢,但接種DSE真菌可減緩下降趨勢,在0.3% NaCl濃度下尤為顯著,表明接種DSE有助于植株提高對NaCl脅迫的抗性,提高白皮松生物量。

3.2 接種DSE對NaCl脅迫下白皮松光合的影響

葉綠素是植物光合作用所必需的色素,其含量的變化直接影響光合作用[27-28]。在本研究中,接種DSE真菌在各鹽濃度脅迫下均顯著提高白皮松葉綠素含量,表明接種DSE真菌能促進葉綠素的合成,這與以往研究結果一致。鹽脅迫下,植物光合作用主要受氣孔因素和非氣孔因素影響,在外界脅迫程度較輕的情況下,氣孔因素影響光合作用較大,當脅迫程度加深則以非氣孔因素為主[29-31]。本研究中,接種白皮松的凈光合速率均高于CK組,表明接種DSE真菌促進了白皮松的光合作用。但隨著鹽脅迫增加,接菌與CK組的白皮松凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率呈下降趨勢;CK組胞間CO2濃度在0%～0.1% NaC脅迫下,胞間CO2濃度升高,而在0.2% NaCl下出現(xiàn)下降,這可能與植物長時間受到鹽脅迫作用有關。凈光合速率降低而胞間CO2濃度升高,表明鹽脅迫使白皮松光合作用主要受到了非氣孔因素的影響,而CK組胞間CO2濃度比接種白皮松下降更早,可能因植株受損更嚴重所致,葛晉金等[32]的研究也得到了胞間CO2濃度下降的研究結果,他們認為這可能與鉀離子的缺乏有關,本研究中接種DSE真菌則緩解了植株受到的傷害。

3.3 接種DSE對NaCl脅迫下白皮松葉綠素熒光參數(shù)的影響

葉綠素熒光參數(shù)可以反映植物光合作用PSⅡ階段對光能的吸收利用和轉化分配能力[33]。研究表明植物受到鹽脅迫后,會導致ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC值升高,而ETo/RC值下降,使得PSⅡ潛在活性中心受損[34-36]。在本研究中,NaCl脅迫使白皮松單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)、熱耗散掉的能量(DIo/RC)整體呈上升趨勢,但在各鹽濃度下接菌處理的白皮松各值顯著低于CK組;接種Pr、Pm、Av菌株的白皮松單位反應中心捕獲的用于還原QA的光能(TRo/RC)整體呈上升趨勢,CK組和接種At菌株的白皮松呈先上升后下降趨勢,猜測可能由于NaCl造成植株受損嚴重所致;接菌白皮松用于傳遞電子的能量(ETo/RC)變化幅度小,而CK組下降顯著。以上結果表明鹽脅迫使得白皮松光合反應中心受到損傷,用于還原QA的能量降低,電子傳遞的能量減少,同時熱耗散增加,導致光合作用能力下降,但相對于CK組,接菌處理能緩解光合反應中心受到損傷,其中接種Pr、Pm、Av菌株緩解的效果相對于At菌株較好。

3.4 接種DSE對NaCl脅迫下白皮松離子含量的影響

鹽脅迫下,Na+的過度積累會造成K+含量的降低[37]。但接種DSE真菌有利于改善植株K+含量。侯立峰[21]研究表明,隨NaCl濃度的增加,油蒿地上油松Na+/K+比值逐漸上升,接種DSE真菌能促進K+吸收,顯著降低油蒿地下Na+/K+比值,提高油蒿耐鹽性。在本研究中,白皮松植株中Na+含量隨鹽脅迫的增加而增加,K+/Na+比值顯著下降,表明Na+的積累破壞了白皮松的離子穩(wěn)態(tài)。在0.3% NaCl濃度,接種Pm、Av菌株的白皮松Na+含量顯著低于CK組,表明接種Pm、Av菌株可能有利于減輕NaCl脅迫對白皮松的傷害;在0.1% NaCl濃度下接種Pr菌株,白皮松地上部分K+含量得到顯著提高,而在0.2%和0.3% NaCl濃度,接種DSE真菌的白皮松地下部分K+含量相較于CK組均有所提高。這也導致接菌白皮松在0.2%、0.3% NaCl濃度下K+/Na+比值相較于未接菌白皮松有所提高,表明接種DSE真菌有利于幫助提高寄主植物對K+的吸收,緩解因K+和Na+競爭而導致的離子穩(wěn)態(tài)失衡。

4 結 論

菌種回接耐鹽性試驗表明,適度的NaCl脅迫可促進侵染率提高。接種DSE真菌有利于提高白皮松生物量,促進光合作用。通過對白皮松體內地上和地下部分離子含量分析發(fā)現(xiàn),接種DSE真菌有利于抑制Na+向地上部分移動,促進地下K+離子的吸收,從而提高K+/Na+比值,維持離子穩(wěn)態(tài)。