吳昊，王靈昭 ，王珊，杜靜，邱春江，程守禮，程成

（1.江蘇海洋大學 海洋食品與生物工程學院，江蘇 連云港 222005；2.連云港市雙程釀造食品有限公司，江蘇 連云港 222221）

醬油是我國傳統(tǒng)的調味品，在人們生活中扮演重要角色[1]。醬油中含有人體所必需氨基酸、維生素C及鋅、鐵等一些微量元素[2]。近年來，隨著人們生活水平的提高，人們對醬油種類和營養(yǎng)價值提出更高的要求。紫菜營養(yǎng)價值較高，富含蛋白質、氨基酸、礦物質和維生素等營養(yǎng)物質；此外紫菜中還含有多糖、藻膽蛋白和多酚等活性物質，具有良好的抗氧化、抗腫瘤和免疫調節(jié)等功效，因而深受人們的喜愛[3-6]。以紫菜為原料發(fā)酵醬油，不僅能豐富醬油的類別，還可提升醬油的鮮味和營養(yǎng)價值[7]。但是紫菜質地致密，細胞壁難以被破壞使得紫菜中多糖和胞內蛋白等營養(yǎng)物質難以被釋放，導致其在醬油加工中利用率較低，因此在紫菜醬油生產中，破壞紫菜細胞壁并提高其利用率成為亟待解決的問題[8]。

超微粉碎技術是一種新興的食品加工技術，可破壞物料細胞結構，將其粉碎至微米甚至納米級[9]，增大物料的比表面積來提高活性物質的提取率[10]。目前超微粉碎技術已經廣泛地應用于食品工業(yè)生產中，可顯著提高多糖、蛋白質和膳食纖維等的提取率[11-12]。牛瀟瀟等[13]的研究結果表明，超微粉碎技術可以顯著提高馬鈴薯渣中可溶性膳食纖維的含量。劉慧君等[14]利用超微粉碎-酶解法提取龍眼多糖，研究結果表明，龍眼多糖得率可達38.49%；相對于傳統(tǒng)方法，提取率提高了90.74%。李振江等[15]采用超微粉碎處理樺褐孔菌粗粉，其多糖的提取率可達16.87%，較處理前得率提高了18.72%。綜上可知，超微粉碎技術可有效破壞物料細胞壁，提高功能性物質的提取率。

本試驗以紫菜為原料，采用普通粉碎與超微粉碎方式預處理紫菜，對紫菜醬油釀造過程中的關鍵酶活力和理化性質進行評價，探究不同粉碎技術對紫菜醬油品質的影響。在此基礎上，研究種曲接種量、制曲時間和制曲溫度對紫菜醬油成曲蛋白酶活力的影響，采用響應面法優(yōu)化制曲工藝，提高紫菜醬油釀造中原輔料的利用率，以期為紫菜醬油的高效生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉：江蘇灌云縣春旺面粉廠；大豆、壇紫菜：連云港市雙程釀造食品有限公司；條斑紫菜：連云港金喜食品有限公司；食鹽（未加碘）：江蘇金橋制鹽有限公司；醬油曲精：上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司；石油醚、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、硫酸銅（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

酸度計（pHS-25）：上海儀電科學儀器股份有限公司；分析天平（BS323S）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；粘度計（NDJ-5S）：上海力辰科技有限公司；水浴鍋（HH-3A）：金壇市科杰儀器廠；粉碎機（HH-3A）：東莞市房太電器有限公司；新型超微粉碎機（CWF-300S）：溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；高壓蒸煮鍋（CWF-300S 型）：諸城市方達食品機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

紫菜醬油的工藝流程見圖1。

圖1 紫菜醬油的工藝流程Fig.1 Production process of laver soy sauce

紫菜醬油制作依據(jù)公司提供的實際生產工藝進行，具體操作如下。

1）原料處理：將200 g 大豆洗凈，加入25 ℃清水浸泡8 h，使大豆吸水膨脹，潤水量達到120%；干紫菜通過超微粉碎機或普通粉碎機進行粉碎，得到紫菜粉；將180 g 小麥粉與20 g 紫菜粉按9∶1（質量比）進行混合，后按料液比2∶1（g/mL）加入清水攪拌，制成1 cm3小麥粉紫菜餅塊。

2）蒸煮：將大豆和小麥粉紫菜餅塊分別置于溫度為120 ℃的旋轉蒸煮鍋內蒸20 min。

3）制曲：將小麥粉紫菜餅塊與大豆混勻后冷卻至一定溫度，接入醬油曲精（種曲）后置于通風良好的恒溫恒濕室內制大曲。

4）配制鹽水：食鹽與清水混合制成濃度為17% 的鹽水，置于冷藏室內降溫至5 ℃，待用。

5）發(fā)酵：將3）中所制大曲與4）中所配制的鹽水按1∶2.2（g/mL）比例混合，攪拌均勻后置于發(fā)酵玻璃罐中進行發(fā)酵。發(fā)酵條件：在恒溫恒濕室內發(fā)酵初始溫度15 ℃，以每天升高1 ℃淋油1 次為標準，直到溫度達到30 ℃；然后在30 ℃恒溫環(huán)境中發(fā)酵165 d，取原油待檢測。

1.3.2 不同粉碎方式對成曲酶活力和醬油理化指標的影響

選用壇紫菜和條斑紫菜兩種紫菜，研究不同粉碎方式對紫菜醬油釀造中成曲蛋白酶活力、糖化酶活力和醬油理化指標的影響。將干燥的壇紫菜和條斑紫菜分別進行普通粉碎和超微粉碎，普通粉碎組過50 目篩，超微粉碎組過1 000 目篩后進行制曲，制得4 組紫菜粉，即普碎壇紫菜組、普碎條斑紫菜組、超碎壇紫菜組和超碎條斑紫菜組，以不加紫菜（普通醬油組）為對照組。

1.3.3 制曲工藝對超微粉碎壇紫菜醬油成曲蛋白酶活力的影響

物料蒸煮冷卻后接種曲種，并至于恒溫恒濕室內，間隔一段時間取樣并測定成曲中蛋白酶活力?？疾熘魄鷷r間（24、30、36、42、48、54 h）、種曲接種量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）和制曲溫度（28、30、32、34、36 ℃）對紫菜醬油成曲蛋白酶活力的影響。

1.3.4 制曲工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素的基礎上，基于Box-Behnken 采樣原理，以種曲接種量（A）、制曲時間（B）、制曲溫度（C）為因素，以蛋白酶活力為響應值，設計三因素三水平響應面試驗，因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels in response surface tests

1.3.5 指標測定方法

氨基酸態(tài)氮的測定參考GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[16]方法進行；黏度的測定按照GB/T 10247—2008《粘度測量方法》[17]進行；蛋白酶活力的測定參考SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[18]進行；糖化酶活力的測定參考GB 1886.174—2016《食品安全國家標準食品添加劑食品工業(yè)用酶制劑》[19]方法進行；總糖含量按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]中直接滴定法測定；淀粉含量的測定參考GB 5009.9—2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》[21]方法進行；全氮含量的測定參考GB/T 18187—2000《釀造食醋》[22]中全氮測量方法進行；還原糖含量的測定按照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》[23]方法進行。

1.3.6 原輔料利用率測定

1.3.6.1 蛋白質利用率

原輔料中蛋白質利用率計算公式如式（1）所示。

式中：m為蛋白質利用率，%；G為紫菜醬油頭油的實際產量，g；T為實測紫菜醬油頭油的全氮含量，g/100 mL；d為紫菜醬油頭油的相對密度；G1為紫菜醬油二油的實際產量，g；T1為實測紫菜醬油二油的全氮含量，g/100 mL；d1為紫菜醬油二油的相對密度；P為原輔料中蛋白質總質量，g；6.25 為紫菜醬油中全氮折算蛋白質系數(shù)。

1.3.6.2 總糖利用率

原輔料中總糖含量計算公式如式（2）所示。

式中：s，原輔料中總糖含量，g；T1為大豆中碳水化合物含量，%；T2為小麥粉中碳水化合物含量，%；D1為大豆中淀粉含量，%；D2為小麥粉中淀粉含量，%；Z為紫菜中總糖含量，%；m1為大豆總質量，g；m2為小麥粉總質量，g；z為紫菜實測總質量，g；0.9 為總糖折算成淀粉質量系數(shù)。

原輔料中總糖利用率根據(jù)式（3）計算。

式中：t為總糖利用率，%；G為紫菜醬油頭油的實際產量，g；d為紫菜醬油頭油的相對密度；G1為紫菜醬油二油的實際產量，g；d1為紫菜醬油二油的相對密度；M為實測紫醬油頭油總糖含量，g/mL；M1為實測紫菜醬油二油總糖含量，g/mL；s為原輔料中總糖含量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Prism 7.0 和SPSS 24.0 對數(shù)據(jù)分別進行繪圖處理和顯著性分析，并采用Design-Expert 10.0.1 軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 普通粉碎與超微粉碎紫菜制曲酶活力分析

不同粉碎方式對制曲蛋白酶和糖化酶活力的影響如圖2 所示。

圖2 不同粉碎方式對制曲蛋白酶和糖化酶活力的影響Fig.2 Effects of different grinding methods on protease and glucoamylase activities in the koji

由圖2A 可知，同一粉碎工藝下紫菜制成的大曲在24、30、36、42、48 h 和54 h 所測得的蛋白酶活力具有顯著差異（P<0.05）。對照組在36 h 蛋白酶活力達到最大值，普通粉碎組蛋白酶活力高峰均出現(xiàn)在42 h，而超微粉碎組蛋白酶活力高峰出現(xiàn)在48 h；未添加紫菜組大曲蛋白酶活力最高，超微粉碎組最低，相比于壇紫菜組，條斑紫菜組具有更高的蛋白酶活力。由圖2B可知，糖化酶與蛋白酶活力呈現(xiàn)相似的變化趨勢。隨著制曲時間的延長，不同粉碎工藝下蛋白酶和糖化酶活力均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，分析其原因可能是種曲中的米曲霉在生長后期產生大量孢子，導致酶活力下降。紫菜多糖的大量浸出使得體系黏度上升，并與其它原料黏結在一起；通風性較差進一步導致曲霉呼吸能力下降，種曲的活力受到抑制，生長發(fā)育較為緩慢[24]，從而導致超微粉碎組蛋白酶活力高峰較普通粉碎組和未添加紫菜組推遲。

2.2 不同粉碎方式對醬油理化性質的影響

不同粉碎方式對醬油黏度和氨基酸態(tài)氮含量的影響如圖3 所示。

圖3 不同粉碎方式對醬油黏度和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effects of grinding methods on the viscosity and amino acid nitrogen content of laver soy sauce

由圖3A 可知，隨著發(fā)酵時間的延長，普通醬油黏度呈平緩上升趨勢，而紫菜醬油黏度呈現(xiàn)快速上升并趨于平緩的趨勢；發(fā)酵180 d 后，超碎壇紫菜組、超碎條斑紫菜組、普碎壇紫菜組和普碎條斑紫菜組醬油的黏度分別為34.26、31.12、21.35、19.21 mPa·s，而普通醬油黏度僅為4.28 mPa·s，低于紫菜醬油黏度。相比于普通粉碎方式，無論是條斑紫菜還是壇紫菜，超微粉碎紫菜醬油均具有更高的黏度。超微粉碎使紫菜細胞壁破碎率提高，紫菜多糖得到充分釋放[25]，從而使得超微粉碎紫菜醬油的黏度高于普通粉碎紫菜醬油。

由圖3B 可知，超微粉碎醬油中氨基酸態(tài)氮含量低于普通粉碎紫菜醬油中氨基酸態(tài)氮的含量，可能是因為經過超微粉碎后紫菜多糖大量溶出和小麥粉混合蒸煮后，黏性變大，原料結塊，使得曲霉的活性降低，從而導致曲霉產酶能力下降[25-26]。此外，隨著發(fā)酵的進行，醬油黏度值變高，微生物及相關酶發(fā)酵受到影響，所以超微粉碎組醬油氨基酸態(tài)氮含量低于普通粉碎組。

2.3 制曲工藝優(yōu)化單因素試驗

為改善醬油品質，有必要優(yōu)化制曲工藝來提高種曲中米曲霉的活性，提升產酶能力和蛋白酶活力，進而提高醬油中氨基酸態(tài)氮含量和原輔料的利用率。超微粉碎壇紫菜醬油具有較好的黏度，但氨基酸態(tài)氮含量較低，因此以超微粉碎壇紫菜為原料，對醬油釀造中制曲工藝進行單因素優(yōu)化，分析制曲時間、種曲接種量和制曲溫度對成曲蛋白酶活力的影響。

2.3.1 制曲時間對紫菜醬油成曲蛋白酶活力的影響

制曲時間對紫菜醬油成曲蛋白酶活力的影響如圖4 所示。

圖4 制曲時間對成曲蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of koji preparation time on the protease activity in the koji

由圖4 可知，紫菜醬油在制曲時間為30~54 h 時，蛋白酶活力隨制曲時間的延長呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。在制曲時間為48 h 時，曲料中的蛋白酶活力達到最大值1 994.15 U/g；隨著制曲時間的進一步延長，曲料中的營養(yǎng)物質和水分含量不斷減少，從而導致曲霉生長受阻礙，曲料蛋白酶活力有所下降[27]。綜上，選擇制曲時間48 h 左右進行后續(xù)響應面試驗。

2.3.2 種曲接種量對紫菜醬油成曲的蛋白酶活力的影響

種曲接種量對紫菜醬油成曲的蛋白酶活力的影響如圖5 所示。

圖5 接種量對成曲蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on the protease activity in the koji

由圖5 可知，種曲接種量為0.2%~0.6% 時，蛋白酶活力隨著種曲接種量的增加出現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當種曲接種量為0.5% 時，蛋白酶活力達到大值；當接種量大于0.5% 時，蛋白酶活力則呈下降趨勢。原因可能是前期種曲接種量較小，種曲中米曲霉無法在短時間內擴大培養(yǎng)，其分解蛋白質的能力不足，制曲底物的營養(yǎng)過剩，從而導致成曲的蛋白酶活力下降；隨著種曲接種量的增大，會引起供氧不足，且制曲的基料無法滿足大量米曲霉成長所需的營養(yǎng)物質，導致個體生長狀況不佳，影響曲霉孢子的成熟，最終使成曲的蛋白酶活力下降[28]。綜上，選擇種曲的最佳接種量0.5% 左右進行后續(xù)響應面試驗。與制曲時間相比，接種量單因素中蛋白酶活力整體較低，種曲以及試驗批次會造成蛋白酶活力存在一定的誤差，但仍呈現(xiàn)一定的變化趨勢，后續(xù)將采用響應面試驗對最佳工藝進行預測和分析。

2.3.3 制曲溫度對紫菜醬油成曲蛋白酶活力的影響

制曲溫度對紫菜醬油成曲蛋白酶活力的影響如圖6 所示。

圖6 制曲溫度對成曲蛋白酶活力的影響Fig.6 Effect of koji preparation temperature on the protease activity in the koji

由圖6 可知，隨著制曲溫度在28~36 ℃時，蛋白酶活力先上升后下降，在制曲溫度為32 ℃時達到峰值，可達1 892.92 U/g；制曲溫度較低時，曲霉發(fā)芽緩慢，蛋白酶活力受到抑制，而當溫度過高時，曲料中水分損失加快，早期制曲階段便會發(fā)干，水分活度太低而導致蛋白酶活力下降。溫度過高或者過低均會影響蛋白酶活力[29]。由上可知，選擇制曲溫度32 ℃左右進行響應面試驗。

2.4 響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，進行紫菜醬油制曲的配方優(yōu)化，結果如表2 所示，并利用Design-Expert 10.0.1軟件對響應面試驗結果進行回歸擬合，得到二次多項式回歸方程為Y= 2 082.1-13.058 5A+10.216 3B-76.619 3C-66.422 6AB+3.594 19AC+53.735 1BC-187.191A2-315.722B2-281.615C2。

對響應蛋白酶活力預測數(shù)學模型進行方差統(tǒng)計分析，結果如表3 所示。

由表3 可知，根據(jù)F值可知，影響蛋白酶活力的不同工藝參數(shù)按貢獻大小排序為C>A>B，即制曲溫度>接種量>制曲時間。模型的決定系數(shù)R2為0.987 7，說明模型擬合優(yōu)度較高，并且R2Adj= 0.971 9，能夠解釋試驗97.19% 的響應值變化，并與預測相關系數(shù)R2pred相差不大，表明該模型具備較高預測精準度。綜上，上述模型可用于分析和預測最優(yōu)制曲工藝條件。

各因素交互作用對蛋白酶活力的影響如圖7 所示。

圖7 各因素交互作用對蛋白酶活力的影響Fig.7 Effects of interactions between factors on protease activity

由圖7 可知，種曲接種量和制曲時間交互作用等高線呈現(xiàn)橢圓形，且表3 中顯示其P<0.05，表明二者交互作用對蛋白酶活力影響顯著[30]。當種曲接種量A一定時，隨著制曲時間B的延長，成曲蛋白酶活力先上升后下降。同理，當制曲時間B不變時，隨著種曲接種量A的提高，成曲中蛋白酶活力也呈現(xiàn)先增加后減小趨勢。僅考慮二者因素作用下的最優(yōu)工藝組合為種曲接種量A為0.45%~0.55%，制曲時間B為45~51 h。

隨著種曲接種量和制曲溫度的增加，蛋白酶活力呈現(xiàn)先增后減的趨勢，表3 中其交互作用結果P值顯示為無顯著性，表明接種量與制曲溫度交互作用對蛋白酶活力影響較小。種曲接種量A為0.45%~0.55%、制曲溫度C為31~33 ℃時，成曲蛋白酶活力較高。相較而言，制曲溫度方向曲面波動幅度較大，表明相比于種曲接種量，制曲溫度對蛋白酶活力影響較大。

蛋白酶活力隨制曲時間和制曲溫度的增加呈先增后減的趨勢，且在制曲溫度方向的影響較大。當制曲時間為45~51 h，制曲溫度為31~33 ℃時，蛋白酶活力較高。為進一步確定全局最優(yōu)解，以蛋白酶活力最大值為優(yōu)化目標，根據(jù)Design-Expert 10.0.1 軟件運行結果，在種曲接種量A、制曲時間B和制曲溫度C共同影響下的最優(yōu)工藝為種曲接種量A為0.50%、制曲時間B為48.06 h、制曲溫度C為31.73 ℃，在此條件下模型預測的蛋白酶活力值可達到2 087.58 U/g。

2.5 結果驗證

根據(jù)軟件預測結果，結合實際工藝設置的可行性，取種曲接種量A為0.5%、制曲時間B為48 h 和制曲溫度C為32 ℃，并采用此工藝處理超微粉碎壇紫菜（驗證組）、超微粉碎條斑紫菜和普通粉碎壇紫菜（試驗組），隨機選擇表2 中序號為9 的工藝處理超微粉碎壇紫菜（對照組），對預測工藝進行進一步驗證。紫菜醬油理化指標如表4 所示。

表4 紫菜醬油理化指標Table 4 Physicochemical indexes of laver soy sauce

由表4 可知，驗證組的蛋白酶活力為2 109.00 U/g，與響應面模型分析相差21 U/g，可證明以該響應面模型為試驗基礎分析出的優(yōu)化方法有效且可行性高。此外，超微粉碎條斑紫菜和超微粉碎壇紫菜醬油中氨基酸態(tài)氮和全氮含量可達到國家釀造醬油特級醬油要求（氨基酸態(tài)氮含量≥0.8 g/100 mL，全氮含量≥1.5%）。超微粉碎組成曲蛋白酶活力低于普通粉碎組，但醬油黏度高于普通粉碎組。相比于普通粉碎壇紫菜醬油，超微粉碎壇紫菜可將醬油黏度提高64.5%。超微粉碎條斑紫菜醬油較超微粉碎壇紫菜醬油具有較高的氨基酸態(tài)氮和全氮含量，但還原糖含量和黏度較低。

2.6 紫菜醬油中原輔料利用率

紫菜醬油生產中原料利用率、醬油出品率作為醬油生產技術的重要參數(shù)，是評價紫菜醬油生產工藝水平高低的重要參考依據(jù)。因此，準確分析紫菜醬油原料利用率、氨基酸態(tài)氮生產率、總糖利用率等對于紫菜醬油的高效利用有重要意義。不同粉碎方式紫菜醬油經濟指標如表5 所示。

表5 紫菜醬油經濟指標Table 5 Economic indicators of soy sauce produced with laver

由表5 可知，相比于普通粉碎方式，壇紫菜經超微粉碎后，紫菜醬油中的蛋白質和總糖的利用率分別提高5.91% 和3.99%；與超微粉碎壇紫菜醬油結果類似，條斑紫菜經超微粉碎后，紫菜醬油中蛋白質和總糖利用率分別提高6.05% 和3.56%。紫菜經過超微粉碎處理后細胞壁結構被破壞，蛋白質和糖類物質暴露出來，在蛋白酶的作用下，蛋白質可分解為小分子的肽；而糖類物質在酶作用下水解為多糖和還原糖，提高了多糖利用率和醬油黏度。

3 結論

本研究以紫菜、小麥、大豆為原料，結合不同粉碎技術處理紫菜釀造紫菜醬油。相比于普通粉碎方式，超微粉碎技術預處理紫菜可提高紫菜醬油的黏度，但會降低成曲中蛋白酶活力。超微粉碎紫菜醬油制曲工藝優(yōu)化結果表明，當種曲接種量為0.50%、制曲時間為48 h、制曲溫度為32 ℃時，成曲中蛋白酶活力可達到2 109.00 U/g。最優(yōu)工藝條件下，相比于普通粉碎方式，超微粉碎方式可有效提高紫菜醬油釀造中原輔料的蛋白質和總糖利用率，使紫菜醬油中氨基酸態(tài)氮和全氮含量達到國家特級醬油的標準，這為高效生產紫菜醬油提供參考。