何茜，劉陽，徐方旭 ，王澤，5，柳葉飛，6

（1.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；3.沈陽師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 沈陽 110034；4.遼寧省功能性蛹蟲草重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110034；5.沈陽市功能性蛹蟲草產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，遼寧 沈陽 110034；6.遼寧省蛹蟲草種質(zhì)資源庫，遼寧 沈陽 110034）

蛹蟲草（Cordycepsmilitaris），又名北冬蟲夏草、蟲草花，屬子囊菌門、核菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，為該屬的模式種之一[1-4]。作為“新資源食品”，蛹蟲草的藥理作用與冬蟲夏草極為相似，其藥用成分蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性等均高于冬蟲夏草，具有抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、抗衰老、提高免疫力等功效[5]。

糖尿病是一種慢性疾病，長期服用降糖藥可引起食欲改變、血小板減少、乳酸蓄積、腎功能損害、維生素B12吸收受阻等，甚至?xí)?dǎo)致巨幼紅細(xì)胞性貧血和心腦血管疾病[6-7]。鉻是葡萄糖耐量因子的重要組成成分，作為胰島素增強(qiáng)劑，鉻對維持人體內(nèi)正常的糖代謝起關(guān)鍵作用[8-9]。研究表明，Cr3+在人體中含量極少[10-13]，而無機(jī)鉻對人體的毒性較大，有機(jī)鉻安全性相對較高[14-17]，且易被人體吸收，具有緩解應(yīng)激[18-19]、增強(qiáng)免疫力、改善胴體品質(zhì)等作用[20-21]。

基于以上背景，本研究以蛹蟲草子實(shí)體為載體，富集人體必需的微量元素鉻，探討蛹蟲草的耐鉻能力和富鉻作用，以及鉻元素對蛹蟲草產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，并借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選出富鉻蛹蟲草的差異基因，找到差異基因參與的代謝通路，旨在闡明蛹蟲草富集鉻元素的分子機(jī)理，為糖尿病替代治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草PT07：沈陽師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所栽培，-80 ℃冰箱儲存；吡啶甲酸鉻（純度：99.9%）：陜西源倍春生物科技有限公司；馬鈴薯：市售；葡萄糖、瓊脂粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂（均為分析純）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；總RNA 提取試劑RNAiso Plus、PrimesoriptTMRT reagent kit with DNA Eraser 試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；脫氧核糖核酸酶I：北京凡知醫(yī)學(xué)科技有限公司；NEB Next Ultra RNA 文庫制備試劑盒：美國NEB 公司；Oligo（dT）磁珠：蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；裂解緩沖液：上海恒斐生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ESJ-182 電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Illumina HiSeq 4000 高通量測序平臺系統(tǒng)：武漢基諾賽克科技有限公司；Agilent 2100 生物分析儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蛋白胨3 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1 g、去離子水1 000 mL，于121 ℃條件下滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1 g、去離子水1 000 mL，于121 ℃條件下滅菌30 min。

栽培培養(yǎng)基：小麥40 g，去離子水或鉻溶液60 mL，于121 ℃條件下滅菌30 min。

1.3.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)

在配制好的PDB 培養(yǎng)基中添加吡啶甲酸鉻，使鉻元素的添加濃度分別為0、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 μg/mL，裝液量為100/250（mL/mL），于121 ℃條件下滅菌40 min，冷卻至常溫后接種，接種量為10%。在22 ℃條件下130 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)5 個(gè)重復(fù)。

將發(fā)酵后的培養(yǎng)液于4 000 r/min 離心15 min 后過濾獲得菌絲體，用去離子水洗滌3 次，充分洗去附帶的培養(yǎng)基成分，沖洗過的菌絲體于60 ℃烘干至恒重，測定菌絲體生物量。

1.3.3 固體平板培養(yǎng)

根據(jù)液體發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果，將活化的蛹蟲草菌株接種于鉻元素含量分別為200、400、600、800 μg/mL 滅菌后的PDA 平皿培養(yǎng)基中心，以未添加鉻元素作為對照組，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)5 個(gè)重復(fù)，于22 ℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后，測量菌落直徑。

根據(jù)GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測定》[22]測定蛹蟲草菌絲體中鉻元素含量，富鉻率（G，%）計(jì)算公式如下。

式中：m為菌絲體中鉻元素含量，mg/kg；C為菌絲體生物量，g/100 mL；M為培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度，μg/mL。

1.3.4 鉻元素對蛹蟲草產(chǎn)量及品質(zhì)的影響

以加去離子水為空白對照組，添加不同濃度的鉻溶液作為試驗(yàn)組（鉻元素添加濃度分別為200、400、600、800 μg/mL）。使用直尺測量直徑（cm）、高度（cm），按如下公式計(jì)算生物轉(zhuǎn)化率（T，%）、污染率（R，%）。

式中：n為蛹蟲草子實(shí)體干重，g；N為小麥培養(yǎng)基干重，g；s為組內(nèi)污染盒數(shù)；S為組內(nèi)總盒數(shù)。

1.3.5 總RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測序

對照組（CK）：栽培培養(yǎng)基中未添加鉻元素的蛹蟲草子實(shí)體；試驗(yàn)組（SY）：栽培培養(yǎng)基中鉻元素濃度為400 μg/mL 的蛹蟲草子實(shí)體。稱取對照組和試驗(yàn)組蛹蟲草樣本各200 mg，每組樣品3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序試驗(yàn)。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time- quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）驗(yàn)證試驗(yàn)

RT-qPCR 引物如表1 所示，總RNA 提取采用Trizol試劑盒；cDNA 合成采用PrimesoriptTMRT reagent kit with DNA Eraser 試劑盒。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 在液體發(fā)酵培養(yǎng)條件下的耐鉻能力

為確定蛹蟲草在液體發(fā)酵培養(yǎng)條件下的耐鉻能力，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)對蛹蟲草菌絲體的生物量進(jìn)行測定，如圖1 所示。

圖1 不同濃度鉻元素對蛹蟲草菌絲生物量的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of chromium on the mycelial biomass of Cordyceps militaris

由圖1 可知，在液體發(fā)酵培養(yǎng)條件下，蛹蟲草菌絲生物量隨鉻元素添加濃度的增大呈先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度在0~400 μg/mL 范圍內(nèi)，隨鉻元素添加濃度的增大，蛹蟲草菌絲生物量也不斷增加，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度達(dá)到400 μg/mL 時(shí)，蛹蟲草菌絲生物量達(dá)到最高值0.53 g/100 mL，且與對照組相比差異顯著（P<0.05）；而培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度為400~1 000 μg/mL 時(shí)，隨鉻元素添加濃度的增大，蛹蟲草菌絲生長明顯受到抑制，鉻元素添加濃度為1 000 μg/mL 時(shí)，蛹蟲草菌絲基本不能生長，表明添加過高濃度的鉻元素會產(chǎn)生一定的毒性。綜上，在液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，鉻元素的最適添加濃度為400 μg/mL。

2.2 在液體發(fā)酵培養(yǎng)條件下的富鉻作用

為確定蛹蟲草菌絲在液體發(fā)酵培養(yǎng)條件下的富鉻作用，對蛹蟲草菌絲的鉻含量和富鉻率進(jìn)行測定，如圖2 所示。

圖2 不同濃度鉻元素對蛹蟲草菌絲中鉻含量和富鉻率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of chromium on the chromium content and the chrome-rich rate in Cordyceps militaris mycelia

從圖2 可以看出，在液體發(fā)酵培養(yǎng)條件下，蛹蟲草菌絲中鉻含量隨鉻元素添加濃度的增大呈先上升后下降的趨勢，在鉻元素添加濃度為600 μg/mL 時(shí)，蛹蟲草菌絲中鉻含量達(dá)到最高值4.5 mg/kg，且與對照組相比差異顯著（P<0.05）。但是從蛹蟲草菌絲的富鉻率可以看出，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度為400 μg/mL 時(shí)，富鉻率達(dá)到最大值0.34%，這與菌絲生物量達(dá)到最大時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度一致。綜上所述，在蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，添加鉻元素濃度以400 μg/mL 為宜。

2.3 在固體平板培養(yǎng)條件下的耐鉻能力

為確定蛹蟲草在固體平板培養(yǎng)條件下的耐鉻能力，對蛹蟲草菌絲的菌落直徑進(jìn)行測定，如圖3 所示。

圖3 不同濃度鉻元素對菌落直徑的影響Fig.3 Effects of different concentrations of chromium on the colony diameter

從圖3 可知，當(dāng)固體培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度在0~400 μg/mL 范圍時(shí)，菌落直徑與鉻元素添加濃度呈正相關(guān)性，在鉻元素添加濃度為400 μg/mL 時(shí)達(dá)到最大值6.0 cm，且與對照組相比差異顯著（P<0.05）；而隨著固體培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度的不斷增加，菌絲生長受到抑制，與液體發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果一致。

2.4 在固體平板培養(yǎng)條件下的菌絲形態(tài)

添加不同鉻元素對蛹蟲草菌絲生長狀態(tài)的影響，如圖4 所示。

圖4 不同鉻濃度對蛹蟲草菌絲形態(tài)的影響Fig.4 Effect of different chromium concentrations on the mycelium morphology of Cordyceps militaris

從圖4 中可以直觀地看出蛹蟲草菌絲在固體平板上的生長狀態(tài)。蛹蟲草菌絲在未添加鉻元素的培養(yǎng)基里，長勢良好，厚薄均勻。培養(yǎng)基中添加200~400 μg/mL鉻元素后，菌落直徑與對照組相比明顯增大，且長勢正常，表明低濃度的鉻元素有助于蛹蟲草的生長；當(dāng)培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度增大時(shí)，菌落直徑逐漸變小，且菌絲邊緣出現(xiàn)稀疏狀態(tài)，表明培養(yǎng)基中鉻元素濃度過高會對蛹蟲草的生長產(chǎn)生一定的抑制作用。

2.5 不同濃度鉻元素對蛹蟲草生長狀態(tài)的影響

添加不同鉻元素對蛹蟲草栽培時(shí)生長狀態(tài)的影響，如圖5 所示。

圖5 不同濃度鉻元素對蛹蟲草生長狀態(tài)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of chromium on the growth of Cordyceps militaris

由圖5 可知，與對照組相比，低濃度鉻元素的添加不僅未影響蛹蟲草的生長，而且提高了蛹蟲草的外觀品質(zhì)，但高濃度的鉻元素對蛹蟲草子實(shí)體的生長影響較大，在鉻元素添加濃度為800 μg/mL 時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體發(fā)生了畸變，甚至出現(xiàn)了一定程度的病原菌感染，表明高濃度的鉻元素不僅抑制了蛹蟲草的生長，而且具有一定的致病性。

2.6 不同濃度鉻元素對蛹蟲草農(nóng)藝性狀的影響

添加不同鉻元素對蛹蟲草子實(shí)體農(nóng)藝性狀的影響，如表2 所示。

表2 不同濃度鉻元素對蛹蟲草農(nóng)藝性狀的影響Table 2 Effects of different concentrations of chromium on the agronomic trait of Cordyceps militaris

從表2 可以看出，蛹蟲草栽培培養(yǎng)基中添加了鉻元素后，子實(shí)體的直徑、高度、生物轉(zhuǎn)化率隨培養(yǎng)基中鉻元素添加濃度的增加而呈先上升后下降的趨勢，在鉻元素添加濃度為400 μg/mL 時(shí)，子實(shí)體高度和生物轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最大值，且與對照組相比，差異顯著（P<0.05），這與液體發(fā)酵培養(yǎng)和固體平板培養(yǎng)的結(jié)果吻合。培養(yǎng)基中添加較高濃度的鉻元素后，污染率明顯提高，可見較高濃度的鉻元素對蛹蟲草子實(shí)體的生長具有一定的脅迫作用，降低了子實(shí)體對病原菌的抵抗能力。

2.7 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)分析

樣品經(jīng)過上機(jī)測序，得到圖像文件，由測序平臺自帶軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成原始數(shù)據(jù)，即下機(jī)數(shù)據(jù)。對每個(gè)樣品的下機(jī)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總，結(jié)果如表3 所示。

從表3 可以看出，各組有效數(shù)據(jù)約占原始數(shù)據(jù)的91.45%、91.06%、90.56%、90.93%、91.03%、91.19%；對照組和試驗(yàn)組堿基測序錯(cuò)誤率分別為0.02% 和0.03%；純化后Q20 堿基比大于97%，Q30 堿基比大于93%，鳥嘌呤和胞嘧啶含量大于50%。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)豐富，質(zhì)量高。

2.8 差異基因表達(dá)分析

采用R 語言ggplots2 軟件包繪制差異表達(dá)基因的火山圖，展示基因分布情況、基因的表達(dá)倍數(shù)差異和顯著性，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 差異基因表達(dá)火山圖Fig.6 Volcano map of differential expression genes

由圖6 可知，蛹蟲草栽培培養(yǎng)基中添加鉻元素后，與對照組相比共篩選出8 512 個(gè)差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs），根據(jù)p<0.05 和|log2差異倍數(shù)|>1 進(jìn)一步篩選出796 個(gè)差異顯著表達(dá)基因，其中上調(diào)基因483 個(gè)，下調(diào)基因313 個(gè)。

2.9 基因本體（gene ontology，GO）富集分析

采用Top GO 進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 GO 功能注釋Fig.7 GO functional annotation

由圖7 可知，差異基因在細(xì)胞組分這類中，分子功能富集最明顯的GO 功能包括核糖體構(gòu)成、結(jié)構(gòu)分子活動、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、蛋白激酶活性、激酶活性；生物過程富集最明顯的GO 功能包括細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞高分子代謝過程、細(xì)胞蛋白質(zhì)新陳代謝過程、基因表達(dá)、高分子生物合成過程、細(xì)胞生物合成過程、小分子代謝過程、蛋白質(zhì)生物代謝過程、細(xì)胞氨基酸代謝過程、海藻糖代謝過程、細(xì)胞胺代謝過程、金屬離子輸運(yùn)；細(xì)胞組分富集最明顯的GO 功能包括核糖體、無膜細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)無膜細(xì)胞器。

2.10 京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

使用cluster profiler 進(jìn)行KEGG 富集分析，利用KEGG 通路庫注釋的差異基因?qū)γ總€(gè)通路的基因列表和基因數(shù)目進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如圖8 所示。

從圖8 可以看出，796 個(gè)差異顯著表達(dá)基因共富集到20 條代謝通路。其中，注釋到核糖體、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、甲烷代謝和氨基酸生物合成5 條通路的基因較多。

2.11 關(guān)鍵KEGG 代謝通路與差異表達(dá)基因解析

差異表達(dá)基因富集的關(guān)鍵KEGG 代謝通路主要有絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）代謝通路、谷胱甘肽代謝通路、硫代謝通路、氨基酸代謝通路、核糖體途徑這5 個(gè)代謝通路，結(jié)果見表4。

表4 關(guān)鍵KEGG 通路的差異表達(dá)基因解析Table 4 Analysis of DEGs enriched in key KEGG pathways

由表4 可知，MAPK 代謝通路能夠在細(xì)胞受到不同的外界刺激后，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生不同的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)[22]。MSN4主要編碼鋅指蛋白的合成，MSN4基因上調(diào)表明細(xì)胞受到鉻元素脅迫后產(chǎn)生適應(yīng)性，有助于蛹蟲草在鉻元素刺激后的正常生長，有利于活細(xì)胞的正常代謝。GSH2基因上調(diào)表明鉻元素環(huán)境下蛹蟲草中谷胱甘肽合成酶上升，緩解了蛹蟲草在鉻元素脅迫下產(chǎn)生的氧化應(yīng)激壓力。此外，鉻元素主要是通過硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入到細(xì)胞中，MET16和CYC1基因明顯下調(diào)意味著鉻元素抑制了細(xì)胞中硫酸鹽的攝取[23-24]。由此可見，在富鉻蛹蟲草的培育過程中，適量補(bǔ)充硫可以減輕鉻元素對蛹蟲草的脅迫[25]。

2.12 RT-qPCR 對基因表達(dá)的驗(yàn)證

進(jìn)一步選取代表性差異表達(dá)基因MSN4、MPK3/6、GSH2、MET16對轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證，結(jié)果如圖9 所示。

圖9 4 種代表性差異表達(dá)基因的表達(dá)圖譜Fig.9 Expression pattern of four representative DEGs

從圖9 可以看出，與對照組（CK）相比，MSN4、MPK3/6、MET16基因表達(dá)水平提高，GSH2基因表達(dá)水平下降，且差異明顯，這與關(guān)鍵KEGG 通路的差異基因表達(dá)的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本文探究了不同濃度鉻元素對蛹蟲草生長和質(zhì)量的影響，結(jié)果表明無論是液體發(fā)酵培養(yǎng)、固體平板培養(yǎng)、還是栽培過程中，培養(yǎng)基中的鉻元素最適添加濃度均為400 μg/mL。高濃度的鉻元素會抑制蛹蟲草的生長，主要表現(xiàn)為污染率升高、子實(shí)體畸變。此外，通過對富鉻蛹蟲草（400 μg/mL）和普通蛹蟲草的Illumina HiSeq 4000 高通量測序分析，篩選出796 個(gè)差異顯著表達(dá)基因，并解析了差異顯著表達(dá)基因的代謝通路，從分子水平闡明蛹蟲草富鉻作用的機(jī)制。