伯年國(guó)，劉琨毅，李若愚，王藤，梁正維，沙艮，陳思琴，陳紅艷，馬燕 ，趙明

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)院，食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644100）

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）不僅是一種存在于發(fā)酵乳制品、谷物等食品中的乳酸菌[1-2]，而且是一種具有調(diào)節(jié)免疫功能與腸道功能等生理功效的微生物[3-4]。植物乳桿菌可以提高食品風(fēng)味、改善食品品質(zhì)，因此廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)[5]。例如，Ge 等[6]利用植物乳桿菌與釀酒酵母共同發(fā)酵小麥面條，結(jié)果表明，共同發(fā)酵改善了小麥面條的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提升了小麥面的風(fēng)味。王紫琳等[7]利用植物乳桿菌發(fā)酵雪蓮果，開發(fā)了一款特色雪蓮果植物發(fā)酵飲料。馬曉娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后枸杞漿的風(fēng)味得到明顯改善，抗氧化活性顯著提升。鄧成林等[9]利用植物乳桿菌發(fā)酵綠茶飲料顯著提升了其風(fēng)味及口感，增強(qiáng)了綠茶飲料的抗氧化活性。馮雪娜等[10]利用植物乳桿菌發(fā)酵紅茶飲料，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后紅茶飲料的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)增加，營(yíng)養(yǎng)成分更加豐富，極大提升了口感。因此，植物乳桿菌是一種益生菌，可以維持人體腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)腸道免疫系統(tǒng)，同時(shí)也是一種能提高發(fā)酵食品品質(zhì)的發(fā)酵劑。

普洱熟茶是以云南大葉種茶樹[（Camelliasinensisn.）var.assamiea（Masters）Kitmaura]的一芽二葉或三葉制成的曬青茶為原料，經(jīng)微生物后發(fā)酵而成的茶產(chǎn)品[11]。微生物發(fā)酵是普洱熟茶加工的關(guān)鍵步驟[12]，不僅形成了普洱熟茶滋味醇和、湯色紅褐、陳香顯著的風(fēng)味[13]，而且決定了普洱熟茶具有降脂減肥、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)損傷、抑制α-葡萄糖苷酶等功能[14-16]。已有研究表明植物乳桿菌參與了普洱熟茶發(fā)酵。郝彬秀等[17]總結(jié)了參與普洱熟茶發(fā)酵的微生物，發(fā)現(xiàn)霉菌（黑曲霉、米曲霉、青霉等）、酵母（Blastobotrysadeninivorans、釀酒酵母等）、細(xì)菌（凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌等）是主要微生物。Bian 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，普洱熟茶發(fā)酵過(guò)程中乳酸桿菌科、嗜熱霉屬、芽孢桿菌科等細(xì)菌可以將不溶性多糖分解并生成具有多種生物活性的2 型單糖和影響茶葉滋味的羧酸。李晨晨等[19]研究發(fā)現(xiàn)普洱熟茶發(fā)酵過(guò)程中存在大量嗜熱細(xì)菌，例如植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸片球菌等細(xì)菌。發(fā)酵中存在植物乳桿菌，表明普洱熟茶具有開發(fā)為富含益生菌產(chǎn)品的潛力。

強(qiáng)化發(fā)酵（enhanced fermentation，EF）是將一種外源微生物接入到未經(jīng)滅菌的原料中進(jìn)行發(fā)酵，進(jìn)而提高發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的一種方式[20]。前期通過(guò)接種產(chǎn)黃青霉P1、地衣芽孢桿菌L1、接種傘枝犁頭霉A1、阿曲霉A1 強(qiáng)化發(fā)酵普洱熟茶，發(fā)現(xiàn)接菌發(fā)酵提高了茶褐素和可溶性糖含量，降低了兒茶素、兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和表沒(méi)食子兒茶素含量，茶湯的甜味和厚重感分?jǐn)?shù)增加，苦味、澀味和酸味分?jǐn)?shù)降低提升了茶葉品質(zhì)[21-24]。本研究從普洱熟茶中分離鑒定得到的植物乳桿菌接種于普洱熟茶發(fā)酵中進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，分析發(fā)酵樣品的感官品質(zhì)特征、化學(xué)成分及微生物群落結(jié)構(gòu)，以期應(yīng)用該菌生產(chǎn)出一款富含植物乳桿菌的普洱熟茶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬青毛茶（一芽三葉）原料：普洱市茶葉科學(xué)研究所；沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）、兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocahechin-3-gallate，EGCG）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（catechin-3 - gallate，CG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（gallocahechin-3-gallate，GCG）、沒(méi)食子兒茶素（gallocatechin，GC）、咖啡堿（caffeine，CA）、鞣花酸（ellagic acid，EA）、木犀草素（luteolin，Lut）、楊梅素（myricetin，Myr）、槲皮素（quercetin，Que）、山奈酚（kaempferol，Kea）、茶堿（theophylline，Theo）、花旗松素（taxifolin，Tax）、蘆?。╮utin，Rut）標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼思特生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒：北京諾禾致源科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均為分析純）：美國(guó)TEDIA 試劑公司；磷酸、鹽酸（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；MRS 肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNA 聚合酶（2×Rapid Taq Master Mix）：南京諾唯贊生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

756CRT 型紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；CP214 型電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；CT15RE 型離心機(jī)：日本日立公司；101A-2型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱：上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠；CS-2000 型高速多功能粉碎機(jī)：武義海納電器有限公司；SW-CJ-1B 型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；1200 型高效液相色譜[配有TSKgel ODS-80TM 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）]：美國(guó)安捷倫公司；Trident 960 型基因擴(kuò)增儀：上海力新儀器有限公司；DW-86L626 型醫(yī)用低溫保存箱：青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；YS6060 型色差儀：深圳市三恩時(shí)科技有限公司；XB.K.25 型血球計(jì)數(shù)板：上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物乳桿菌PET003 分離鑒定

對(duì)從普洱熟茶中分離純化得到的菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，并進(jìn)行16S rRNA 基因序列測(cè)序分析。

1.3.2 植物乳桿菌PET003 強(qiáng)化發(fā)酵普洱熟茶試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[21-24]的方法，稱取30 kg 曬青毛茶，量取茶樣質(zhì)量30% 的純凈水進(jìn)行潮水靜置一夜。將茶葉裝入發(fā)酵筐（50 cm×40 cm×60 cm），每隔5 d 翻堆一次，25 d 后發(fā)酵完成。前期研究發(fā)現(xiàn)第20 天時(shí)接菌發(fā)酵的普洱熟茶品質(zhì)最好，因此，本研究在第20 天時(shí)取出5 kg 茶葉，接入茶葉質(zhì)量0.1% 的植物乳桿菌PET003發(fā)酵劑置于底層。用紗布將其與其他未接菌的隔開一同靜置發(fā)酵，25 d 時(shí)結(jié)束發(fā)酵。采用5 點(diǎn)取樣法取樣，-80 ℃貯藏備用；將未接入植物乳桿菌PET003 的樣品命名為CK，接入植物乳桿菌PET003 強(qiáng)化發(fā)酵的樣品命名為EF，每組樣品進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3 高通量測(cè)序分析微生物多樣性

使用細(xì)菌DNA 提取試劑盒來(lái)提取茶樣中的細(xì)菌DNA，并利用DNA 聚合酶與引物338F 和806R 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3.4 乳桿菌菌落計(jì)數(shù)

采用GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》檢測(cè)方法對(duì)茶樣中乳桿菌屬進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 茶葉化學(xué)成分測(cè)定

參照GB/T 8305—2013《茶水浸出物測(cè)定》、GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測(cè)定》、GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》的方法分別測(cè)定水浸出物（water extracts，WE）、游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AA）、茶多酚（tea polyphenols，TP）的含量。采用蒽酮硫酸法[21]測(cè)定可溶性糖（soluble sugars，SS），采用萃取比色法[25]測(cè)定茶紅素（thearubigins，TR）、茶黃素（theaflavins，TF）及茶褐素（theabrownins，TB）的含量。采用高效液相色譜法定量茶樣中兒茶素組分含量[26]。

1.3.6 茶樣感官審評(píng)

5 位具有評(píng)茶資格的人員（3 女2 男），根據(jù)GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》對(duì)茶葉樣品進(jìn)行感官審評(píng)。

1.3.7 定量描述分析

使用定量描述分析法對(duì)茶湯的滋味特征進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中包括苦味、澀味、酸味、甜味和醇厚感這5 個(gè)屬性。每個(gè)屬性的評(píng)分范圍從0~9，其中0 表示較弱，9 表示較強(qiáng)[27]。同時(shí)，使用YS6060 型色差儀來(lái)測(cè)定茶湯的顏色。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行主成分分析。使用TBtools 1.09854 繪制歸一化后的數(shù)據(jù)的聚類熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌的分離鑒定結(jié)果

菌株P(guān)ET003 的菌落形態(tài)及微觀特征見圖1 與圖2。

圖1 菌株P(guān)ET003 的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain PET003

圖2 菌株P(guān)ET003 的革蘭氏染色顯微觀察Fig.2 Gram staining microscopic observation of strain PET003

由圖1 可知，將菌株接種到MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d 后，菌落形態(tài)呈圓形、乳白色、表面光滑凸起、邊緣整齊、不透明的菌落。由圖2 可知，經(jīng)革蘭氏染色后均為紫色，呈桿狀或棒狀，單個(gè)或成鏈狀。

將菌株測(cè)序所得序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選擇模式物種進(jìn)行建樹分析，結(jié)果如圖3 所示。菌株P(guān)ET003 與LactiplantibacillusplantarumATCC_14917 聚為一支，因此將PET003 鑒定為植物乳桿菌。

圖3 細(xì)菌16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA gene sequence

2.2 發(fā)酵樣品植物乳桿菌數(shù)量

各茶樣植物乳桿菌菌落數(shù)見表1。

表1 各茶樣植物乳桿菌菌落數(shù)Table 1 Lactiplantibacillus plantarum colony number in tea samples

由表1 可知，應(yīng)用平板計(jì)數(shù)法分析接菌發(fā)酵樣的菌落為2.07×106CFU/g，顯著高于對(duì)照樣（6.00×105CFU/g，P<0.05）。由此可知接入植物乳桿菌強(qiáng)化發(fā)酵過(guò)程中，植物乳桿菌可以存活，并作用于發(fā)酵過(guò)程，更重要的是，干燥后存在大量植物乳桿菌，表明開發(fā)了一款富含植物乳桿菌的普洱熟茶。

研究發(fā)現(xiàn)，在傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)菌的片球菌屬、芽孢桿菌屬、短狀桿菌屬、歐文氏菌屬、特布爾西菌屬、乳桿菌屬占優(yōu)勢(shì)地位，同時(shí)乳桿菌屬呈現(xiàn)出在第一、二次翻堆時(shí)增加隨后開始減少、出堆時(shí)增加的趨勢(shì)[28]。因此，植物乳桿菌在普洱熟茶出堆后還大量存在。本研究為了進(jìn)一步研究接入植物乳桿菌PET003 強(qiáng)化發(fā)酵普洱熟茶出堆樣中乳酸菌的生長(zhǎng)情況，應(yīng)用Illumina MiSeq 測(cè)序技術(shù)，測(cè)定16S rRNA 基因序列，對(duì)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖4。發(fā)酵樣品細(xì)菌目水平群落結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖4 EF 與CK 乳桿菌屬（Lactobacillus）DNA 序列片段數(shù)柱狀圖Fig.4 Column graph of Lactobacillus reads in tea samples with enhanced fermentation（EF）and control fermentation（CK）

圖5 EF 與CK 細(xì)菌目水平群落結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Community structure of bacteria in tea samples with enhanced fermentation（EF）and control fermentation（CK）

由圖4、圖5 可知，強(qiáng)化發(fā)酵樣品中歸為乳桿菌屬（Lactobacillus）的DNA 序列片段數(shù)顯著增加（P<0.05），表明接菌發(fā)酵增加了植物乳桿菌的數(shù)量。接菌發(fā)酵樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要是微球菌（Micrococcales）（62%）、Staphylococcales（13%）、乳桿菌目（Lactobacillales）（10%）。傳統(tǒng)發(fā)酵樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要是微球菌目（Micrococcales）（46%）、鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）（16%）、假單胞菌目（Pseudomonadales）（13%）。比較發(fā)現(xiàn)，接入植物乳桿菌PET003 發(fā)酵顯著增加了乳桿菌目（Lactobacillales）、微球菌目（Micrococcales）的相對(duì)豐富度。而植物乳桿菌屬于乳桿菌目（Lactobacillales），因此接入植物乳桿菌PET003 發(fā)酵改變了普洱熟茶發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)，增加了植物乳桿菌的數(shù)量。

2.3 發(fā)酵茶葉品質(zhì)

為評(píng)估發(fā)酵茶樣品質(zhì)，對(duì)樣品進(jìn)行審評(píng)結(jié)果見表2、圖6~圖8。

表2 傳統(tǒng)發(fā)酵（CK）與強(qiáng)化發(fā)酵（EF）感官審評(píng)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of tea samples with enhanced fermentation（EF）and control fermentation（CK）

圖6 CK 的感官審評(píng)照片F(xiàn)ig.6 Sensory evaluation photos of control

由圖6、圖7 可知，樣品茶湯均呈紅褐色，但接菌發(fā)酵后茶湯顏色更深。由圖8 可知，接菌發(fā)酵樣的甜味（4.82±0.17）、醇厚感（6.82±0.19）顯著高于傳統(tǒng)發(fā)酵（P<0.05），澀味（1.19±0.15）、酸味（0.31±0.02）顯著低于傳統(tǒng)發(fā)酵（P<0.05），滋味更加醇厚順滑、陳香持久無(wú)堆味。

圖7 EF 的感官審評(píng)照片F(xiàn)ig.7 Sensory evaluation photos of enhanced fermentation

圖8 發(fā)酵樣茶湯的滋味特征Fig. 8 Taste characteristics of fermented tea soup

應(yīng)用色差儀測(cè)定茶湯色差值的結(jié)果見圖9。

圖9 發(fā)酵樣品茶湯的顏色參數(shù)Fig.9 Color parameters of tea soup of fermented tea sample

由圖9 可知，EF 的L* 值（36.13±0.00）、a* 值（45.92±0.05）和b* 值（57.79±0.18）顯著高于CK（P<0.05），結(jié)果與審評(píng)結(jié)果相符。因此接入植物乳桿菌發(fā)酵增加了茶湯湯色。

茶樣特征成分的結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵茶樣特征成分含量Table 3 Contents of characteristic components of fermented tea samples

由表3 可知，EF 樣品的可溶性糖（5.11±1.02）%、茶褐素（14.41±0.33）%、茶多酚（7.57±1.63）%、兒茶素（0.15±0.03）mg/g、兒茶素沒(méi)食子酸酯（0.12±0.00）mg/g、咖啡堿（52.92±0.12） mg/g、沒(méi)食子兒茶素（34.50±0.22）mg/g 和表兒茶素（0.13±0.04）mg/g 含量均顯著高于CK（P<0.05）。有研究表明，可溶性糖、茶褐素、游離氨基酸、簡(jiǎn)單兒茶素含量與茶湯甜度和厚度呈正相關(guān)[29]，因此，該結(jié)果與感官審評(píng)EF 茶湯色澤紅褐，滋味的甜度與醇厚感高于CK 相符，與代祥青等[30]的研究結(jié)果一致。因此，植物乳桿菌PET003 強(qiáng)化發(fā)酵提高了普洱熟茶的風(fēng)味品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究從普洱熟茶中分離得到的植物乳桿菌PET003 在發(fā)酵第20 天時(shí)接種于茶樣中進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，發(fā)酵后樣品的乳桿菌目（Lactobacillales）、微球菌目（Micrococcales）和植物乳桿菌屬的DNA 序列片段數(shù)量增加，含2.07×106CFU/g 的植物乳桿菌。接菌發(fā)酵后茶樣中可溶性糖、茶褐素、游離氨基酸、咖啡堿、兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量顯著高于對(duì)照茶樣，顯著提升了茶葉的品質(zhì)。因此，本研究開發(fā)了一種富含植物乳桿菌，且感官品質(zhì)優(yōu)良的普洱熟茶。