肖楊斌 方鎧寧

1 湖南省岳陽市人民醫(yī)院胃腸外科 414000; 2 岳陽市婦幼保健院婦科

結(jié)腸癌(Colon cancer,CC)是臨床上常見的消化道惡性腫瘤,在全球的發(fā)病率一直很高,每年導(dǎo)致大量死亡,排在惡性腫瘤和致死病因的第四位,已成為嚴(yán)重威脅人類身體健康的惡性腫瘤之一[1]。盡管已經(jīng)開發(fā)了綜合治療方案,但結(jié)腸癌的預(yù)后仍不理想,這可能歸因于缺乏早期診斷和有效的靶向藥物[2]。miRNA是短的非編碼RNA分子,由20～24個(gè)核苷酸組成,其主要通過完全或不完全結(jié)合靶基因的3’-UTR來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。近年來的研究表明,部分miRNA可能是結(jié)腸癌的候選預(yù)后和診斷生物標(biāo)志物[4]。研究表明miR-141-3p對(duì)肺腺癌[5]、鼻咽癌[6]細(xì)胞的遷移、增殖、凋亡活動(dòng)等都存在調(diào)控作用。MYT1L是一小組緊密相關(guān)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,先前有研究表明,miR-338-3p可通過靶向MYT1L而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[7]。目前對(duì)miR-141-3p和MYT1L在結(jié)腸癌中的機(jī)制研究較少。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞為體外研究對(duì)象,探討miR-141-3p靶向調(diào)控MYT1L對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展的影響,從而探究miR-141-3p和MYT1L在結(jié)腸癌中的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD841CON、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT8、SW480和HCT116購自中國(guó)北納生物。胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購自美國(guó)Invitrogen公司;青霉素和鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine2000試劑購自美國(guó)Gibco公司;Trizol、結(jié)晶紫購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;qScript cDNA合成試劑盒購自美國(guó)Quantabio公司;miScript SYBR Green PCR試劑盒購自德國(guó)Qiagen公司;所有引物均購自上海生工生物工程有限公司;CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司;Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自美國(guó)Biovision公司;phRL-SV40對(duì)照載體購自美國(guó)Promega公司;24孔Transwell室購自美國(guó)Corning公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液購自中國(guó)索萊寶公司;MyT1L兔多克隆抗體、GAPDH兔單克隆抗體、山羊抗兔IgG H&L(HRP)購自英國(guó)Abcam公司、NC膜購自美國(guó)Millipore公司;ECL試劑盒購自中國(guó)碧云天公司;流式細(xì)胞儀購自國(guó)BD Biosciences公司。

1.2 生物信息學(xué)方法 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載TCGA-COAD的mRNA、miRNA表達(dá)量數(shù)據(jù),利用edgeR進(jìn)行差異分析(|logFC|>2,Padj<0.05)。并對(duì)差異miRNA進(jìn)行生存分析,確定研究的目標(biāo)miRNA。利用TargetScan、miRDB兩個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)目標(biāo)miRNA進(jìn)行靶向預(yù)測(cè),并與差異mRNA取交集,獲得與目標(biāo)miRNA具有靶向結(jié)合位點(diǎn)的差異mRNA。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT8、SW480和HCT116在含有10%FBS,100μg/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD841CON在含有10%FBS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在37℃的含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及載體質(zhì)粒構(gòu)建 細(xì)胞按1.2×106/孔接種至6孔板中,待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí),將NC mimic和miR-141-3p mimic分別經(jīng)Lipofectamine2000試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到各組結(jié)腸癌細(xì)胞中,并在含有5% CO2、37℃的培養(yǎng)基中培養(yǎng),6h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用慢病毒包裝構(gòu)建MYT1L的表達(dá)載體。合成帶有KpnI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)的MYT1L cDNA(pUC-MYT1L)和其對(duì)照序列pUC-NC序列(序列由BLOCK-iTTMRNAi Deshgner網(wǎng)站設(shè)計(jì)),使用T4連接酶將其連接到慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-neo 上并轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。

1.5 qRT-PCR檢測(cè) 用Trizol從細(xì)胞中提取總RNA。使用qScript cDNA合成試劑盒將1μg的miR-141-3p和MYT1L總RNA分別用于合成cDNA,使用miScript SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行定量PCR。內(nèi)參物為U6和GAPDH。PCR條件為:95℃ 2min,接著95℃ 5s和60℃ 30s循環(huán)40次。結(jié)果用2-ΔΔCt值來比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的目的基因miRNA相對(duì)表達(dá)量的差異,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。qRT-PCR引物見表1。

表1 qRT-PCR引物列表

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定。將結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT8的細(xì)胞以6×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在24孔板中,每孔500μl。細(xì)胞在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。在培養(yǎng)0h、24h、48h和72h時(shí),向每孔加入50μl CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,檢測(cè)450nm處OD值。

1.7 通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估HCT8細(xì)胞的凋亡率 在6孔板中以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度培養(yǎng)HCT8細(xì)胞,并用pUC-MYT1L轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48h后,將細(xì)胞用胰蛋白酶(不含EDTA)消化,然后收集并重懸于PBS(4℃)中。在4 ℃條件下以1 000r/min的轉(zhuǎn)速離心細(xì)胞并去除PBS后,加入結(jié)合緩沖液(1×)重懸細(xì)胞,然后,加入膜聯(lián)蛋白V-FITC凋亡試劑盒中的膜聯(lián)蛋白V-FITC(Biovision,K101)和PI避光染色15min。流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 雙熒光素酶檢測(cè)miR-141-3p和MYT1L的靶向性 將HCT8細(xì)胞以6×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在24孔板中并孵育24h。隨后,用0.8μg pGL3-MYT1L-3’UTR和pGL3-MYT1L-3’UTR Mut質(zhì)粒,用phRL-SV40對(duì)照載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,然后使用Lipofectamine 2000試劑盒將miR-141-3p mimic及其陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后24h使用雙熒光素酶測(cè)定法檢測(cè)海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶活性,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 將大約2×104個(gè)細(xì)胞加入24孔Transwell小室上室中。將含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基填充到下室中。在37 ℃溫育24h后,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌小室3次,用棉簽涂敷器除去未通過膜的細(xì)胞,隨后用4%多聚甲醛固定,并對(duì)膜下表面的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察并拍照。

1.10 Western blot檢測(cè)MYT1L蛋白表達(dá)量 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,將各組細(xì)胞使用冷PBS洗滌3次,隨后加入RIPA裂解液,置于冰上裂解10min。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量,隨后加入10μl上樣緩沖液于95℃煮10min后,于100V條件進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后,在100mA條件下,將蛋白轉(zhuǎn)移(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)至NC膜,封閉液(5% BSA/TBST)封閉60min,加入一抗,4℃過夜孵育,內(nèi)參為GAPDH。一抗:MYT1L(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)。一抗孵育完畢后,用1×TBST溶液洗膜3次,每次5min,加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗:山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶10 000),室溫下孵育120min,1×TBST洗膜3次,每次20min。用ECL試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行顯影,觀察蛋白印記,并進(jìn)行圖像分析。用Quantity One軟件分析條帶灰度值,檢測(cè)MYT1L的相對(duì)表達(dá)量,用目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值之比來表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,兩組間比較為t檢驗(yàn),多組間的比較應(yīng)采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-141-3p在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況 edgeR差異分析結(jié)果顯示,一共獲取299個(gè)差異miRNA和2 065個(gè)差異mRNA (見圖1a)。其中,結(jié)腸癌組織中的miR-141-3p的表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.05,見圖1b)。生存分析結(jié)果顯示,結(jié)腸癌組織中miR-141-3p高表達(dá)患者的總生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)患者(見圖1c)。qRT-PCR檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8、SW480和HCT116和正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD841CoN中 miR-141-3p的表達(dá)量。結(jié)果表明,miR-141-3p在人不同結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)均顯著高于人正常細(xì)胞(見圖1d)。選擇相對(duì)表達(dá)較高的HCT8細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-141-3p在結(jié)腸癌中表達(dá)量高

2.2 miR-141-3p高表達(dá)對(duì)細(xì)胞表型的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-141-3p mimic組的細(xì)胞增殖能力顯著高于NC mimic組(P<0.05,見圖2a)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-141-3p mimic組的細(xì)胞遷移能力顯著高于NC mimic組(P<0.05,見圖2b)。miR-141-3p mimic組的細(xì)胞凋亡率顯著低于NC mimic組(P<0.05,見圖2c)。綜上,miR-141-3p的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的惡性表型。

圖2 過表達(dá)miR-141-3p導(dǎo)致HCT8細(xì)胞表型惡化

2.3 miR-141-3p與MYT1L在結(jié)腸癌細(xì)胞中的關(guān)系 利用TargetScan、miRDB兩個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-141-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),并與下調(diào)的903個(gè)差異mRNA取交集,獲得38個(gè)與miR-141-3p具有靶向結(jié)合位點(diǎn)的靶基因 (見圖3a)。其中,miR-141-3p與MYT1L具有顯著的負(fù)相關(guān)性(見圖3b)。MYT1L在結(jié)腸癌組織中呈現(xiàn)極顯著的低表達(dá)(圖3c)。在HCT8細(xì)胞系中用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染NC mimic和miR-141-3p mimic后,MYT1L的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明,與NC mimic組相比,miR-141-3p mimic組的MYT1L的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05,見圖3d～e)。隨后,利用雙熒光素酶驗(yàn)證靶向關(guān)系。與MYT1L-W+NC mimic共轉(zhuǎn)染組相比,MYT1L-W+miR-141-3p mimic共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而MYT1L-M+miR-141-3p mimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性與MYT1L-M+NC mimic共轉(zhuǎn)染組無顯著差異(P>0.05,見圖3f),表明miR-141-3p可能與MYT1L的3’UTR結(jié)合。綜合上述結(jié)果可知miR-141-3p與MYT1L之間存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。

圖3 miR-141-3p靶向下調(diào)MYT1L的表達(dá)

2.4 miR-141-3p與MYT1L共同作用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞表型的影響 將HCT8細(xì)胞分組為:pUC-NC+NC mimic組、pUC-MYT1L+NC mimic組、pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic組。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,pUC-MYT1L+NC mimic組細(xì)胞活性顯著低于pUC-NC+NC mimic組(均P<0.05),而pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic組細(xì)胞活性顯著高于pUC-MYT1L+NC mimic組(均P<0.05,見圖4a)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,pUC-MYT1L+NC mimic組細(xì)胞遷移能力顯著低于pUC-NC+NC mimic組(P<0.05),而pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic組細(xì)胞遷移能力顯著高于pUC-MYT1L+NC mimic組(P<0.05,見圖4b)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,pUC-MYT1L+NC mimic組細(xì)胞凋亡率顯著高于pUC-NC+NC mimic組(P<0.05),而pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic組細(xì)胞凋亡率顯著低于pUC-MYT1L+NC mimic組(P<0.05,見圖4c)。

圖4 在HCT8細(xì)胞系中miR-141-3p的上調(diào),通過MYT1L使細(xì)胞表型惡化

3 討論

越來越多的證據(jù)表明,miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在癌癥中發(fā)現(xiàn)了異常的miRNA表達(dá),因此,這些miRNA可能被用來預(yù)測(cè)預(yù)后。miR-141-3p參與了不同組織來源的惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。例如miR-141-3p通過靶向Keap1-Nrf2通路促進(jìn)卵巢癌的增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為[8]。miR-141-3p通過ALKBH5介導(dǎo)的PRMT6的m6A修飾促進(jìn)前列腺癌的惡性進(jìn)展[9]。在本研究中,我們通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)miR-141-3p在結(jié)腸癌組織中高表達(dá),并通過qRT-PCR在細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-141-3p的表達(dá)量顯著高于正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞系。結(jié)合已有的研究報(bào)道,我們猜測(cè)miR-141-3p在結(jié)腸癌中可作為促癌因子。我們將miR-141-3p mimic轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞中,進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示miR-141-3p的上調(diào)可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,遷移并抑制細(xì)胞凋亡。說明miR-141-3p在體外結(jié)腸癌細(xì)胞中有促進(jìn)細(xì)胞表型惡化的作用。

目前對(duì)于miR-141-3p 的研究報(bào)道顯示,其可以通過作用于多個(gè)靶基因發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用,如SUSD2[10]、AK2[11]和NME1[12]等。我們利用多個(gè)靶向預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-141-3p與MYT1L的3’-UTR靶向結(jié)合,并利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的靶向結(jié)合關(guān)系。MYT1L可以將成纖維細(xì)胞重編程為神經(jīng)元,MYT1L的調(diào)控機(jī)制與它的鋅指結(jié)構(gòu)有關(guān),可能是通過MYT1L與DNA特殊位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)活性[13]。研究表明在人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中MYT1L的表達(dá)降低,MYT1L的表達(dá)上調(diào)會(huì)抑制成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖,激活與神經(jīng)元分化相關(guān)的基因表達(dá)程序,并限制細(xì)胞遷移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化基因集的表達(dá)[14]。所以我們推測(cè)miR-141-3p很可能通過靶向下調(diào)MYT1L的表達(dá)來調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。因此,我們比較只轉(zhuǎn)染了pUC-MYT1L和轉(zhuǎn)染了pUC-MYT1L和miR-141-3 mimic兩組的細(xì)胞表型,結(jié)果可以得出miR-141-3p表達(dá)的上調(diào)抑制了MYT1L的表達(dá),并且抑制了MYT1L對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移的下調(diào)作用。表明miR-141-3p可以靶向下調(diào)MYT1L的表達(dá),從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,本研究確定了miR-141-3p對(duì)MYT1L在結(jié)腸癌細(xì)胞中的靶向調(diào)控作用。今后的研究中會(huì)探究MYT1L與信號(hào)通路之間的作用,并在其他結(jié)腸癌細(xì)胞系中進(jìn)行研究。本研究可能為結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程的作用機(jī)制提供了一條新的見解,望能對(duì)其診斷、治療提供新的思路。本研究的不足之處為僅以結(jié)腸癌細(xì)胞株為研究對(duì)象,通過體外實(shí)驗(yàn)對(duì)分子機(jī)制進(jìn)行研究,后續(xù)還有待利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和完善。