黃雅琳，楊天俊，李盛瓊，高 露，馮春紅，梁興新，尹 杰*

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省宣漢縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 宣漢 636150；3.四川省峨眉山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 峨眉山 614200）

牛結(jié)核病是一種傳染性強(qiáng)的慢性消耗性人畜共患病，由牛分支桿菌、結(jié)核分支桿菌等病原引起，其中牛分支桿菌的致病性最強(qiáng)，主要侵害肺及淋巴結(jié)，使之出現(xiàn)干酪性壞死灶和慢性炎性肉芽腫［1］。該病對水牛、黃牛、牦牛、鹿等多種動(dòng)物易感［1］，呈世界性分布，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為B 類傳染病，我國將其列為二類動(dòng)物傳染病。該病無季節(jié)流行性，可通過被污染的空氣、飼料和飲水等經(jīng)呼吸道和消化道感染健康牛，懷孕的母牛也可以通過胎盤傳染胎兒。人一般通過食用未經(jīng)巴氏消毒的生乳及乳制品感染［3］，飼養(yǎng)員、獸醫(yī)等從業(yè)人群也容易感染此病。

隨著我國奶牛業(yè)和肉牛業(yè)的蓬勃發(fā)展以及國內(nèi)外牛產(chǎn)品的頻繁交易，牛結(jié)核病在許多國家普遍流行，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前，我國對牛結(jié)核病的檢疫通常使用牛型提純結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法，此方法適用于牛出生后20 d的活體檢查。體外檢測IFN-γ法也已納入國家標(biāo)準(zhǔn)，其基本原理是PPD遞呈到全血中的淋巴細(xì)胞后，感染過牛分枝桿菌的細(xì)胞在牛分枝桿菌抗原的再次刺激下能產(chǎn)生高水平的IFN-γ，未感染的不會(huì)產(chǎn)生，通過檢測IFN-γ濃度水平來判斷機(jī)體是否感染結(jié)核病。

本研究選取X 縣、E 縣、Z 縣等5 個(gè)地區(qū)的部分牛場進(jìn)行隨機(jī)采樣，通過PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和體外檢測IFN-γ法分別對牛結(jié)核病的感染情況進(jìn)行調(diào)查，以進(jìn)一步加強(qiáng)全省牛結(jié)核病的防控工作，保障畜牧業(yè)生產(chǎn)安全和公共衛(wèi)生安全。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 牛型提純結(jié)核菌素（20頭份/瓶），購自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司成都藥械廠，批號(hào)：1 605003；牛結(jié)核病IFN-γ夾心ELISA 檢測試劑盒（480 孔/盒），購自青島瑞爾唯特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2203001。

1.2 試驗(yàn)用牛 在四川省的X、A、E、Z、K縣（市、區(qū)）各選取14個(gè)牛場，隨機(jī)抽選413頭牛作檢測。

1.3 PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) 參照動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB/T 18645-2002）進(jìn)行，采用牛型提純結(jié)核菌素（PPD）在牛頸部進(jìn)行皮試變態(tài)反應(yīng)，劑量為2 000 IU/頭，分別于注射前和注射后72 h測量皮膚厚度，計(jì)算出皮厚差，并依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.4 牛結(jié)核病體外檢測IFN-γ法 采用IFN-γ夾心ELISA法進(jìn)行檢測。

1.4.1 全血培養(yǎng) 采集?？鼓螅? h 內(nèi)加入24 孔組織培養(yǎng)板，每份全血分3 孔，依次分別加入牛結(jié)核菌素（PPDB）、禽結(jié)核菌素（PPDA）和磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻后37 ℃培養(yǎng)孵育16～24 h，然后吸取上層血漿至1.5 mL EP管中。

1.4.2 IFN-γ試驗(yàn) 加入前面吸取的100 μL上層血漿至相應(yīng)孔中，封板，室溫孵育。洗滌后加入酶標(biāo)抗體，封板，室溫孵育。洗滌后加入底物顯色溶液，封板，避光孵育15 min。加入終止液，5 min內(nèi)酶標(biāo)儀讀取OD450nm值。

1.4.3 結(jié)果判定 結(jié)果的有效性判定：陽性對照OD 值＞0.7，陰性對照OD 值＜0.2。陽性判定：PPDB的OD值-PBS的OD值≥0.1。且PPDB的OD 值-PPDA 的OD 值≥0.1；陰性判定：PPDB 的OD值-PBS的OD值＜0.1，或PPDB的OD值-PPDA的OD值＜0.1。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法的陽性檢出率比較 在被檢的413頭牛中，采用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（GB/T 18645-2002）判定牛結(jié)核病陽性數(shù)為16 頭，陽性檢出率為3.87%。采用體外檢測IFN-γ法（GB/T 32945-2016）判定牛結(jié)核病陽性數(shù)為12 頭，陽性檢出率為2.91%（表1）。

表1 兩種方法的陽性檢出率比較

2.2 兩種方法的符合率比較 對413 頭牛分別用PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和體外檢測IFN-γ法檢測，結(jié)果顯示：這兩種方法的陽性符合數(shù)為11 頭，陽性符合率為78.57%；陰性符合數(shù)為396 頭，陰性符合率為99.25%（表2）。

2.3 四川省5個(gè)縣（市、區(qū)）部分牛場的陽性率比較 體外檢測IFN-γ法是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織認(rèn)可的一種輔助診斷試驗(yàn)方法［4］，以體外檢測IFN-γ法作為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。這5個(gè)地區(qū)所有被抽檢牛場中，牛結(jié)核病的平均陽性率為2.95%，陽性檢出率由高到低依次為：E＞A＞K＞Z＞X（表3）。其中大型規(guī)模養(yǎng)殖場的陽性檢出率為5.00%，小型養(yǎng)殖場的陽性檢出率為2.55%（表4）。不同種類牛群中，陽性檢出率由高到低依次為：奶牛＞牦牛＞肉牛（表5）。

表3 各地區(qū)陽性檢出率比較

表4 養(yǎng)殖場類型比較結(jié)果

表5 不同種類牛群的陽性檢出率比較

3 討論

牛結(jié)核病主要通過實(shí)驗(yàn)室方法診斷，實(shí)驗(yàn)室診斷方法分為細(xì)菌學(xué)檢測方法、分子生物學(xué)診斷技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)［5］，其中免疫學(xué)檢測技術(shù)主要包括PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、體外檢測IFN-γ法等。

有研究表明，體外檢測IFN-γ法和PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)具有互補(bǔ)關(guān)系，這兩種方法聯(lián)合使用被認(rèn)為是提高牛結(jié)核病檢測準(zhǔn)確率的有效方法［6］。我國大部分地區(qū)對牛結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查、進(jìn)出口檢疫等依然采用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)［7］。該方法的免疫學(xué)診斷試劑PPD是多種抗原的混合物，所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌等，因此存在一定的交叉反應(yīng)和非特異性反應(yīng)，可能產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。基于該方法的原理，PPD 只能用于感染早期的檢測，感染后期的檢出率極低，會(huì)漏檢部分感染牛。由于遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響，對于疑似病牛，該方法只能在30 d 后進(jìn)行復(fù)檢，容易造成病原擴(kuò)散和疫情處置延誤。此外，天氣因素、人為因素等也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［8］。

IFN-γ法是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的牛結(jié)核病體外檢測方法，該方法一般作為PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的輔助檢測方法［9］。該方法可以區(qū)分牛分枝桿菌、副結(jié)核或禽分枝桿菌等的感染，減少了假陽性，僅需采一次血，重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化，對結(jié)核病感染后期的牛檢出率較高，但該方法成本高，需由實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員操作，無法廣泛普及。

本研究通過PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和體外檢測IFN-γ方法結(jié)合，對四川省5個(gè)縣（市、區(qū)）的部分牛場開展結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法的陽性符合率高，其中PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的陽性檢出率略高于體外檢測IFN-γ方法，體外檢測IFN-γ方法的準(zhǔn)確度高，證實(shí)了PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法可能存在部分非特異性，體外檢測IFN-γ方法可作為輔助手段用于牛結(jié)核病的診斷和監(jiān)測。另外，大型養(yǎng)殖場的陽性率略高于小型養(yǎng)殖場，其中肉牛結(jié)核病陽性率最低，奶牛結(jié)核病陽性率最高。這可能是由于奶牛對結(jié)核病更易感，而牦牛主要以散養(yǎng)放牧為主，間接促進(jìn)了牛結(jié)核病的傳播。

在實(shí)際應(yīng)用中，養(yǎng)殖場可以進(jìn)行一年兩次的結(jié)核病檢疫。對于有條件的養(yǎng)殖場，可以先用PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行初篩，再對陽性牛應(yīng)用體外檢測IFN-γ法復(fù)檢，不僅避免部分錯(cuò)篩帶來的經(jīng)濟(jì)損失，還可以避免疫情擴(kuò)散。若養(yǎng)殖場能堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，且嚴(yán)格按照要求對結(jié)核病陽性牛進(jìn)行隔離、撲殺，并做好養(yǎng)殖場的消毒，連續(xù)2～3年將可能達(dá)到凈化牛結(jié)核病的目的。

4 結(jié)論

本研究采用PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和體外檢測IFN-γ法對四川省牛結(jié)核病進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，得出牛結(jié)核病陽性率在3%左右。分析兩種方法的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)體外檢測IFN-γ法的陽性率低于皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)。因此，確診牛結(jié)核病比較理想的方法是兩種或兩種以上方法的聯(lián)合使用，在實(shí)際檢疫中單獨(dú)使用PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法會(huì)造成假陽性牛的誤殺，應(yīng)通過體外檢測IFN-γ法對變態(tài)反應(yīng)陽性牛和可疑牛進(jìn)行復(fù)檢，綜合判斷確診，以利于牛結(jié)核病的凈化。