李艷艷，高亞偉，王靖萱，熊蘇悅，于婉真，陳銘堅(jiān)

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.安徽省碭山縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)服務(wù)中心，安徽 碭山 235300；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210000）

金黃色葡萄球菌（SA）簡稱金葡菌，是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。金葡菌引起的奶牛乳房炎具有病程長、傳播速度快、反復(fù)發(fā)作、治愈率低等特點(diǎn)，可對產(chǎn)奶腺體組織造成不可逆的損傷，導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能和奶質(zhì)顯著下降。

1 診斷

1.1 免疫學(xué)診斷

1.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）使用酶標(biāo)記的抗體或抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定，使對應(yīng)的抗原或抗體產(chǎn)生強(qiáng)烈的顯色反應(yīng)，通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)。該法使用方便，具有較好的靈敏度和特異性，適用于大量樣本的檢測。

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法既可以檢測牛奶中是否含有金葡菌，也可以診斷金葡菌性乳房炎。

1.1.2 免疫熒光標(biāo)記技術(shù) 該技術(shù)需要建立針對專門結(jié)合到A蛋白的免疫熒光探針，使用帶有熒光標(biāo)記的抗體，以此捕獲釋放到樣品中的病原，通過特殊儀器測定熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

該方法具有快速、靈敏度高的特點(diǎn)，但是成本較高，并且對檢測人員的專業(yè)性有較高要求。

1.1.3 免疫層析檢測技術(shù) 免疫層析檢測技術(shù)是一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷方法。該方法以抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)和層析反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過毛細(xì)管作用使樣品在層析條上運(yùn)動，進(jìn)而使其與受體結(jié)合產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

該方法操作簡單、檢測快速，能夠直接診斷奶牛是否患有乳房炎。

1.2 分子生物學(xué)診斷 分子生物學(xué)用于金葡菌性奶牛乳房炎的診斷已經(jīng)越來越普遍，檢測方法包括普通PCR法、多重PCR法、實(shí)時(shí)定量PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）等。PCR方法與常規(guī)檢測手段相比，具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，并能確定對應(yīng)的基因型和抗生素耐藥基因的存在，尤其是多重PCR可以同時(shí)進(jìn)行多種病原篩查，其臨床應(yīng)用廣泛。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng) 細(xì)菌的分離鑒定與培養(yǎng)是診斷細(xì)菌性疾病的常用方法。

金葡菌在血平板上培養(yǎng)24 h 后，會形成厚的、有光澤的、隆起的，直徑為1～2 mm 的金黃色菌落，并出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象，即在菌落周圍有透明的溶血環(huán)。革蘭氏染色后，可在顯微鏡下觀察到紫色葡萄串狀的球菌。在細(xì)菌生化反應(yīng)中，金葡菌觸酶試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)均為陽性。

1.4 Accumast 快速診斷培養(yǎng)皿 Accumast 快速診斷培養(yǎng)皿由美國康奈爾大學(xué)Bicalho教授研發(fā)，可在現(xiàn)場進(jìn)行快速診斷。

此培養(yǎng)基中添加了特殊顯色劑，不同病原菌的不同代謝產(chǎn)物可在平板上顯出不同色彩。Ganda等以實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)診斷方法來評估Accumast診斷培養(yǎng)皿對金葡菌的鑒定效果，其靈敏性、特異性分別為100%、99.8%。

1.5 試管凝固酶試驗(yàn) 試管凝固酶試驗(yàn)是診斷金葡菌常用的生化試驗(yàn)。

金葡菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附于細(xì)菌表面，生成凝塊，因而具有抗吞噬的作用。該法巧妙利用了金葡菌此特性進(jìn)行特異性診斷，具有經(jīng)濟(jì)、高效、可靠且快速的特點(diǎn)，在生產(chǎn)實(shí)際中，常采用玻片法、試管法進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)。

1.6 其他實(shí)驗(yàn)室診斷 甘露醇鹽瓊脂測試和脫氧核糖核酸酶測試能夠快速診斷出奶牛乳汁中的金葡菌。Bi-plate 和Tri-plate 培養(yǎng)系統(tǒng)也可用于金葡菌的快速檢測。乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)可用于評估乳腺狀態(tài)和奶?；窘】禒顩r，而乳汁電導(dǎo)率檢查和pH值檢查可以對奶牛乳汁的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，可用于本病的綜合性診斷。

目前基于表型和基因分型方法的分子技術(shù)為診斷本病提供了快速和特異的鑒定方法。中國農(nóng)科院智慧畜牧業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)利用表面增強(qiáng)拉曼納米標(biāo)簽改進(jìn)的免疫滲濾裝置，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度奶牛乳腺炎癥因子白介素-6的檢測，為及早發(fā)現(xiàn)和診斷奶牛乳腺炎提供了新方法。

2 耐藥性與治療

2.1 耐藥性 隨著抗生素的廣泛使用，金葡菌對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，金葡菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)生有水解作用的β-內(nèi)酰胺酶、主動外排系統(tǒng)、耐藥基因以及細(xì)胞膜對藥物通透性降低等。

金葡菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制是通過修飾核糖靶位點(diǎn)，以此影響大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對核糖亞基的親和力。主動外排系統(tǒng)是細(xì)菌的正常生理結(jié)構(gòu)，存在于敏感菌株中，但當(dāng)細(xì)菌被環(huán)境中的底物長時(shí)間誘導(dǎo)時(shí)，其編碼基因的外排系統(tǒng)會被激活和表達(dá)，使得外排藥物的能力顯著增強(qiáng)，從而導(dǎo)致耐藥性。金葡菌的tet（K）基因是其主要耐藥基因，該基因編碼的主動外排機(jī)制能將四環(huán)素類抗菌藥物泵出細(xì)胞外，從而產(chǎn)生耐藥性。

由于金葡菌多樣化的耐藥機(jī)制，使得乳源金葡菌的耐藥性不斷加強(qiáng)。耐甲氧西林金葡菌株（MRSA）是一種耐多藥的“超級細(xì)菌”，其對包括治療金葡菌性奶牛乳房炎的常規(guī)抗生素均有耐藥性。MRSA 等耐藥菌株的出現(xiàn)，給本病的治療帶來了全新的挑戰(zhàn)。

2.2 抗生素治療 抗生素療法是國內(nèi)外普遍采用的治療奶牛乳房炎的常用方法，由于臨床用藥不規(guī)范等原因，使得金葡菌成為較難根治的乳房炎病原之一。同時(shí)，由于其獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制、傳染性、環(huán)境持久性、對皮膚及黏膜的強(qiáng)大粘附能力，使用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療的有效性已近耗竭。

隨著抗生素耐藥性、藥物殘留和公共衛(wèi)生問題的日益突出，抗生素的應(yīng)用受到了諸多限制。因此，尋求新的乳房炎預(yù)防和治療策略已成為當(dāng)下之需。

2.3 替代療法 針對金葡菌的替代治療方法包括使用細(xì)菌素、益生菌、噬菌體和生物活性植物化學(xué)物質(zhì)。大量實(shí)驗(yàn)證明，噬菌體可以有效提高感染細(xì)菌動物的存活率，與抗生素相比，噬菌體制劑特異性高、自我增殖快、開發(fā)時(shí)間短。另外，益生菌也極具治療前景，過氧化乳桿菌、乳酸乳球菌和干酪類乳桿菌在體外對抗幾種引起乳房炎的病原體有良好的效果，它們可以刺激奶牛的免疫應(yīng)答，去除金葡菌生物膜，調(diào)節(jié)病原體在宿主細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化。

有研究證明包括藍(lán)桉、黃芪、柴胡、洋甘菊、薄荷、金銀花、羅勒、蒺藜、艾葉等多種中草藥的提取物具有顯著抑菌效果。中藥消除細(xì)菌耐藥性的作用機(jī)制主要是抑制β-內(nèi)酰胺酶的作用、抑制主動外排泵、抑制細(xì)菌生物膜及細(xì)菌耐藥質(zhì)粒形成等。

2.4 納米制劑療法 納米顆粒的開發(fā)為金葡菌性乳房炎的治療提供了新的思路。納米顆?？商岣哂行лd荷藥物在細(xì)胞內(nèi)的穿透和積累，降低細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性和防止其生物膜形成的能力。

納米抗菌藥物具有廣譜、親水和環(huán)保等許多特性，并且使用天然礦物，無耐藥性產(chǎn)生。

一些納米載體可通過與多種抗菌藥物偶聯(lián)或結(jié)合來促進(jìn)對金葡菌的藥理活性，因此，納米顆粒給藥被認(rèn)為是抑制金葡菌感染的較理想工具。納米顆?？梢栽鰪?qiáng)藥物在細(xì)胞內(nèi)的滲透性，其主要通過增加釋放藥物向主要靶點(diǎn)的擴(kuò)散和被細(xì)胞攝取的能力，以及改善包被或吸附納米顆?？股氐尼尫?，增強(qiáng)抗生素對細(xì)胞內(nèi)金葡菌感染的抗菌活性。

脂質(zhì)體也被認(rèn)為是抗菌藥物在細(xì)胞內(nèi)分布的可能載體，這歸因于其磷脂雙層結(jié)構(gòu)，大單片脂質(zhì)體可作為鏈霉素的載體對抗金葡菌的細(xì)胞內(nèi)感染。使用克拉霉素和達(dá)托霉素負(fù)載脂質(zhì)體的最佳比例也驗(yàn)證了阿奇霉素負(fù)載脂質(zhì)體對MRSA具有更高的殺菌作用。

2.5 中草藥療法 作為我國傳統(tǒng)的醫(yī)藥資源，中草藥具有提高非特異性免疫力和抗菌力的作用，近年來在奶牛乳房炎上應(yīng)用研究也越來越多。

研究表明中草藥提取物，如黃芪多糖，以及中草藥組方制劑對包括金葡菌性奶牛乳房炎具有明顯的治療效果。除了抑菌和抗炎作用，中草藥還能通過活血、化瘀、消腫、散癰等作用改善乳房局部的血液循環(huán)，調(diào)節(jié)乳腺血液供應(yīng)，進(jìn)而修復(fù)乳腺組織，達(dá)到治愈乳房炎的目的。

3 預(yù)防

3.1 抗病育種 早期的抗乳房炎育種研究主要集中在測定臨床乳房炎、乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)及乳房表型等性狀的遺傳參數(shù)方面。不同奶牛品種之間存在著遺傳差異，可以微妙地影響奶牛的生產(chǎn)性能和疾病抗性，從而使人們能夠選擇具有乳房炎抗性遺傳特征的奶牛進(jìn)行繁育。

近年來，隨著分子生物學(xué)尤其是基因組學(xué)以及生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，以功能基因組、轉(zhuǎn)基因?yàn)榇淼姆肿佑N技術(shù)已成為抗乳房炎育種的發(fā)展方向，乳房炎抗性相關(guān)候選基因的研究也取得重大進(jìn)展。如BTA22 基因編碼的乳鐵蛋白具有抑菌和殺菌的作用，BTA23可通過誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答來發(fā)揮其在預(yù)防乳房炎中的作用，而β-防御素基因可在乳腺等組織中受病原的誘導(dǎo)而表達(dá)，對金葡菌等乳房炎致病菌有抗菌活性。

3.2 疫苗預(yù)防 免疫疫苗是控制和終結(jié)大多數(shù)傳染病的首選方法。

市場上也已生產(chǎn)出了多款針對金葡菌性乳房炎的疫苗，如西班牙歐杰諾的MASTIVAC 牛乳房炎滅活疫苗、德國勃林格的Lysigin多價(jià)裂解疫苗、西班牙海博萊用的Startvac 多價(jià)疫苗。市售疫苗具有一定的保護(hù)效力，能在一定程度上降低臨床型乳房炎的發(fā)病率。

在一些發(fā)達(dá)國家，對乳房炎自家苗的研究也已開展起來。針對金葡菌性乳房炎的感染，國外許多農(nóng)場開始使用自家苗，這些疫苗具有很高的畜群特異性，且抗原濃度通常較高，為金葡菌性乳房炎的防治提供了一種新的思路。

3.3 信息化監(jiān)測管理 定期對泌乳期奶牛進(jìn)行乳房炎監(jiān)測是防治和控制乳房炎蔓延的有力措施。

通用信息技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步為現(xiàn)代化乳制品行業(yè)提供了新的技術(shù)支持，同時(shí)也建立了一系列乳房炎防控的信息體系，如使用適配并可連接到智能手機(jī)應(yīng)用程序的納米生物傳感器，可快速檢測牛奶樣本中的病原體，數(shù)字化的擠奶機(jī)控制系統(tǒng)也降低了機(jī)械控制故障而導(dǎo)致的臨床乳房炎的發(fā)病率。不同的傳感器系統(tǒng)可以測量每頭奶牛的生理、行為和生產(chǎn)指標(biāo)。

信息化監(jiān)測管理有助于對金葡菌性乳房炎進(jìn)行監(jiān)測、防控和診斷，并統(tǒng)計(jì)建立出金葡菌性乳房炎的特征性診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也為收集不同類型乳房炎的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，以進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供了便利。