陳永鋒 宋和強(qiáng) 王鵬 郭建偉 陳曉超

骨關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)部位的退行性炎癥病變,常發(fā)于膝、胯、手和脊柱等部位關(guān)節(jié),其主要病理特征為軟骨組織的退變和炎性反應(yīng)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),>65歲的老齡群體中高達(dá)1/2的人患有骨關(guān)節(jié)炎[2]。骨關(guān)節(jié)炎不僅帶來(lái)生理上的疼痛,而且會(huì)導(dǎo)致行動(dòng)困難,甚至殘疾,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,給患者家庭造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[3]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病由多種因素引起,但其發(fā)病的分子調(diào)控機(jī)制還沒(méi)有得到完全的闡明[4]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的主要組成細(xì)胞,其通過(guò)調(diào)控細(xì)胞胞外基質(zhì)和基質(zhì)降解酶的合成和分泌,維持關(guān)節(jié)組織的穩(wěn)態(tài)[5]。在炎性因子的刺激下,軟骨細(xì)胞的新陳代謝過(guò)程被擾亂,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度降解和凋亡,是關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要病理變化[6]。因此,探尋骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控基因,對(duì)于研發(fā)關(guān)節(jié)炎的有效治療方法具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long noncoding RNAs,lncRNA)是長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,具有調(diào)控染色質(zhì)重構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯等多種功能,在細(xì)胞增殖、周期、凋亡和分化等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。研究表明LncRNA參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程,是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNA在骨關(guān)節(jié)炎中異常表達(dá),特別是對(duì)軟骨細(xì)胞的炎癥損傷具有重要的調(diào)控功能[9]。DNA 損傷激活的非編碼 RNA(non-coding RNA-activated by DNA damage,NORAD)是目前研究比較廣泛的一個(gè)新型lncRNA,在哺乳動(dòng)物中高度保守,對(duì)基因組的穩(wěn)定性具有重要的調(diào)控作用,已在多種疾病中報(bào)道了其重要功能[10-12]。值得注意的是NORAD在炎癥相關(guān)的疾病中異常表達(dá),對(duì)炎性反應(yīng)和炎癥引起的細(xì)胞損傷具有重要的調(diào)控作用[13-15]。本研究通過(guò)IL-1β刺激軟骨細(xì)胞建立骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞模型,研究NORAD對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥損傷的調(diào)控功能,并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;重組人IL-1β蛋白購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;總RNA提取試劑TransZol、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)和ECL發(fā)光試劑自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit和實(shí)時(shí)定量熒光PCR試劑盒TB Green Fast qPCR Mix購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;Calcein AM細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒和一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天科技有限公司;人IL-6和TNF-α的 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;兔抗人Bax、Bcl-2、MMP-13、COL2A1和GAPDH一抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔抗人NF-κB p65和phospho-NF-κB p65一抗購(gòu)自上海賽信通生物試劑有限公司;PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;NORAD siRNA和對(duì)照NC siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶,用75%乙醇消毒瓶身,放入37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3～4 h。吸除培養(yǎng)基,PBS清洗細(xì)胞。加入0.25%胰蛋白酶消化液,輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底,37℃溫浴2 min。倒置顯微鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞回縮變圓后,加入完全培養(yǎng)基終止消化。用移液槍吹打瓶壁,使細(xì)胞脫落,按1∶3的比例將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)充新鮮完全培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天更換1次培養(yǎng)液。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將軟骨細(xì)胞按3×104的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,過(guò)夜培養(yǎng),待細(xì)胞完全貼壁后,細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%,進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。將20 pmol待轉(zhuǎn)染的siRNA與100 μL無(wú)血清和無(wú)抗生素的OPTI-MEM培養(yǎng)基混勻,隨后加入2 μL siRNA-mate 轉(zhuǎn)染試劑,快速渦旋 10 s,使其完全混勻。室溫靜置 10 min,使siRNA和轉(zhuǎn)染試劑形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。轉(zhuǎn)染前,更換新鮮培養(yǎng)液,將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中,輕搖混勻,置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后,收集樣品,驗(yàn)證NORAD的表達(dá)水平變化?；虺晒η玫秃?進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。NORAD siRNA(si-NORAD)靶向序列為:5’-GCCACCUUUGUGAACAGUAUA-3’;對(duì)照siRNA(si-NC)靶向序列為:5’-UUCUCCGAACGUGUCU-3’。

1.4 骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型建立和分組 參考文獻(xiàn)[16]報(bào)道方法,建立骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型。將重組人IL-1β蛋白加入到軟骨細(xì)胞培養(yǎng)孔中,使其終濃度達(dá)到10 ng/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將軟骨細(xì)胞分為4組:對(duì)照組(不進(jìn)行任何處理,正常培養(yǎng))、IL-1β組(采用10 ng/mL的IL-1β刺激軟骨細(xì)胞24 h)、IL-1β + si-NC組(轉(zhuǎn)染NC siRNA 48 h后,進(jìn)行IL-1β刺激)和IL-1β + si-NORAD組(轉(zhuǎn)染NORAD siRNA 48 h后,進(jìn)行IL-1β刺激)。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)NORAD表達(dá) 4組細(xì)胞處理完成,倒出培養(yǎng)液,PBS清洗細(xì)胞,加入TransZol,放置片刻,使細(xì)胞充分裂解。用移液槍吹打細(xì)胞,將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心管,加入RNA Extraction Agent,劇烈震蕩15 s,室溫孵育3 min。低溫(2～8℃)10 000 × g離心15 min,將水相轉(zhuǎn)移到新的離心管,采用異丙醇-乙醇抽提法進(jìn)一步提取RNA。將抽提的RNA溶解于RNA溶解液中,以備后續(xù)使用。配置10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:2 μL PrimeScript Buffer,0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix,0.5 μL Oligo dT Primer,0.5 μL Oligo dT Primer,0.5 μL Random 6 mers,500 ng總RNA,加 DEPC處理的水補(bǔ)至10 μL。設(shè)置以下逆轉(zhuǎn)錄程序:37℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)5 min,85℃逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s。配置20 μL PCR反應(yīng)體系:10 μL TB Green Fast qPCR Mix,1 μL前引物,1 μL后引物,2 μL DNA模板,加滅菌水補(bǔ)至20 μL。設(shè)置PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照,采用2-ΔΔCt法計(jì)算NORAD相對(duì)表達(dá)水平。擴(kuò)增引物序列如下:NORAD前引物為5’-TGAAGGCAGAGAAGGAAGGG-3’,后引物為5’-TCCACCACATACACAGCACT-3’;GAPDH前引物為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,后引物為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.6 Calcein AM細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)軟骨細(xì)胞存活率 將軟骨細(xì)胞接種于全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(5 × 103),過(guò)夜培養(yǎng)。根據(jù)1.3分組處理后,吸除培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞。每孔加入100 μL Calcein AM檢測(cè)工作液,37℃避光孵育30 min。孵育結(jié)束后,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波長(zhǎng)494 nm,發(fā)射波長(zhǎng)517 nm)檢測(cè)熒光強(qiáng)度,并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡 將軟骨細(xì)胞按1.3分組處理后,去除培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞。加入免疫染色固定液,室溫固定細(xì)胞30 min。PBS洗滌細(xì)胞,加入免疫染色強(qiáng)力通透液,室溫孵育5 min。將TdT酶和熒光標(biāo)記液混合,配置成TUNEL檢測(cè)液。PBS清洗細(xì)胞,加入TUNEL檢測(cè)液,37℃避光孵育60 min。PBS清洗細(xì)胞,加入DAPI溶液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。PBS清洗細(xì)胞,用抗熒光淬滅封片液封片后,置于熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取3個(gè)固定大小的視野,對(duì)TUNEL染色細(xì)胞(綠色)和總細(xì)胞(藍(lán)色)計(jì)數(shù),以此計(jì)算凋亡細(xì)胞比例。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bax、Bcl-2、MMP-13、COL2A1和NF-κB p65蛋白的表達(dá) 按1.3處理細(xì)胞完成后,去除培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞,加入裂解液,劇烈震蕩15 s,冰上孵育30 min。低溫(2～8℃)14 000×g離心10 min,收集上清液,采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白提取樣品和SDS上樣緩沖液混合,煮沸5 min,進(jìn)行變性處理。將處理后的蛋白樣品,每孔等量地加入到配置好的SDS-PAGE膠,進(jìn)行電泳分離。電泳結(jié)束后,將膠、濾紙和PVDF膜制成三明治結(jié)構(gòu),進(jìn)行轉(zhuǎn)模實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)模完成后,將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中,室溫下密封1 h。用封閉液稀釋第一抗體,與PVDF膜一起孵育,4℃搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。TBST洗膜,將膜與稀釋的HRP標(biāo)記的二抗孵育,室溫1 h。TBST洗膜,將ECL發(fā)光液均勻涂抹于膜上,采用凝膠成像儀進(jìn)行曝光和圖像采集。

1.9 ELISA檢測(cè)IL-6和TNF-α的濃度 根據(jù)1.3處理細(xì)胞完成后,500 × g離心5 min收集上清。將上清液按加入到ELISA板中(100 μL/孔),用封板膜封住反應(yīng)孔,室溫孵育120 min,洗板5次,用厚吸水紙拍干。加入加入生物素化抗體溶液(100 μL/孔),室溫孵育60 min,洗板5次,用厚吸水紙拍干。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Streptavidin(100 μL/孔),室溫孵育20 min,洗板5次,用厚吸水紙拍干。加入顯色劑TMB溶液(100 μL/孔),室溫孵育20 min。加入終止液(50 μL/孔),混勻后立即用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度,計(jì)算相應(yīng)炎性因子濃度。

2 結(jié)果

2.1 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組比較,IL-1β組軟骨細(xì)胞中NORAD的表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組軟骨細(xì)胞中NORAD的表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組軟骨細(xì)胞存活率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組軟骨細(xì)胞存活率提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1、2。

表1 轉(zhuǎn)染si-NORAD對(duì)軟骨細(xì)胞中NORAD表達(dá)水平的影響

表2 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞存活率的影響 %,

2.2 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激軟骨細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組軟骨細(xì)胞凋亡比例增加,(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組軟骨細(xì)胞凋亡比例下降(P<0.01)。與對(duì)照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平上升(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平下降(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組Bax蛋白表達(dá)水平下降(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1、2,表3、4。

圖1 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL×200)

圖2 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

表3 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞凋亡率的影響 %,

表4 Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)相對(duì)定量分析

2.3 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的影響 與對(duì)照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13表達(dá)水平升高,二型膠原蛋白COL2A1表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組MMP-13表達(dá)水平降低,COL2A1表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3,表5。

圖3 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中MMP-13和COL2A1蛋白表達(dá)水平的影響

表5 MMP-13和COL2A1蛋白表達(dá)相對(duì)定量分析

2.4 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞炎性因子分泌的影響 與對(duì)照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組軟骨細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的濃度增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組軟骨細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的濃度降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表6。

表6 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中IL-6和TNF-α分泌水平的影響 pg/mL,

2.5 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中NF-κB激活的影響 與對(duì)照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組NF-κB p65蛋白的磷酸化水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組NF-κB p65蛋白的磷酸化水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4,表7。

圖4 敲低NORAD對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中NF-κB p65蛋白磷酸化的影響

表7 NF-κB p65總蛋白和磷酸化蛋白水平定量分析

3 討論

LncRNA在骨關(guān)節(jié)炎中的作用是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向,有望為闡明骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制和研發(fā)新型治療方法,提供新的突破口[17]。IL-1β是一個(gè)可由多種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展過(guò)程中重要的促炎因子,采用IL-1β刺激軟骨細(xì)胞建立骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型,是目前體外模擬骨關(guān)節(jié)炎廣泛使用的模型[18-20]。本研究在IL-1β刺激軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)lncRNA NORAD表達(dá)水平升高,并且敲低NORAD可以有效減輕IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞的炎癥損傷。本研究表明NORAD可能通過(guò)調(diào)控軟骨細(xì)胞的炎癥損傷在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用。

研究表明NORAD在多種炎癥相關(guān)疾病中異常表達(dá)。NORAD在肺結(jié)核患者的血清中顯著升高,并且與促炎因子IL-1β,TNF-α和IL-6濃度呈正相關(guān)性[13]。在潰瘍性結(jié)腸炎患者來(lái)源的結(jié)腸黏膜組織中,NORAD表達(dá)水平顯著上升[14]。另外,在新生兒敗血癥患者血清中NORAD表達(dá)水平升高,并且與IL-8,TNF-α和IL-6濃度呈正相關(guān)性[21]。目前,關(guān)于NORAD是否在骨關(guān)節(jié)炎中異常表達(dá),筆者所見(jiàn)尚未有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),NORAD在IL-1β刺激軟骨細(xì)胞建立的骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中表達(dá)水平顯著升高。這一結(jié)果表明NORAD在骨關(guān)節(jié)炎中可能高表達(dá),但其具體表達(dá)水平需要通過(guò)檢測(cè)臨床組織來(lái)進(jìn)一步地確定。

NORAD對(duì)炎性反應(yīng)和炎癥引起的細(xì)胞損傷具有重要的調(diào)控作用。在LPS刺激的局巨噬細(xì)胞中,敲低NORAD可以降低炎性因子IL-8、TNF-α和IL-6的分泌水平[21]。在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中,敲低NORAD可以減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[22]。在腎小管上皮細(xì)胞中,敲低NORAD可以減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)[23]。抑制NORAD還可以緩解結(jié)核桿菌感染對(duì)巨噬細(xì)胞的損傷作用,并且抑制炎性反應(yīng)過(guò)程[13]。對(duì)糖尿病性心肌病小鼠靜脈注射NORAD的shRNA可以減輕心肌部位的炎性反應(yīng)[15]。這些研究表明,抑制NORAD具有抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用。本研究檢測(cè)了敲低NORAD是否對(duì)IL-1β刺激引起的效應(yīng)具有調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),通過(guò)轉(zhuǎn)染si-NORAD可以顯著降低IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中NORAD的表達(dá)水平。敲低NORAD可以提高IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞的存活率,抑制細(xì)胞凋亡,阻斷細(xì)胞外基質(zhì)的降解,并且降低炎性因子TNF-α和IL-6的濃度。這些結(jié)果表明,敲低NORAD可以減輕軟骨細(xì)胞受到的炎癥損傷。

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是炎性反應(yīng)的重要調(diào)控因子,在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[24]。在IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中,NF-κB激活下游炎性因子表達(dá),從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn),IL-1β刺激軟骨細(xì)胞增加NF-κB p65蛋白的磷酸化水平,表明NF-κB被激活。值得注意的是敲低NORAD顯著降低NF-κB p65蛋白的磷酸化水平,表明NORAD對(duì)NF-κB信號(hào)通路具有重要的調(diào)控作用,但其具體調(diào)控機(jī)制,還不明確。NORAD主要通過(guò)海綿吸附體的作用吸附微小RNA來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。已有研究表明,NORAD可以作為miR-552-3p的海綿吸附體調(diào)控MyD88的表達(dá),從而影響NF-κB的激活[14]。而關(guān)于NORAD在IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控軸有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,敲低NORAD可以減輕IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥損傷,其保護(hù)作用可能是通過(guò)下調(diào)NF-κB信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡,細(xì)胞外基質(zhì)降解和炎性反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。