支文冰，姜盛楠，孫婷婷，王春柳，宗時宇，陳靜，李曄，劉洋*，張紅*（.陜西省中醫(yī)藥研究院（陜西省中醫(yī)醫(yī)院），西安 7006；.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 7446）

支氣管哮喘簡稱哮喘，是由多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的以氣道慢性炎癥為特征異質(zhì)性疾病，臨床表現(xiàn)咳喘、呼吸短促、胸悶和呼吸困難等[1]。2022年《全球哮喘防治創(chuàng)議》GINA提出世界哮喘日的主題為“消除差距，實(shí)現(xiàn)哮喘的同質(zhì)管理”，流行病學(xué)調(diào)研發(fā)現(xiàn)全球哮喘病患者已達(dá)3億人，其中我國的哮喘病患者約有4570萬[2]。哮喘歷經(jīng)氣道上皮損傷、黏液高分泌、氣道炎性浸潤和氣道平滑肌增生等病理進(jìn)程，但哮喘作為一種多因素誘導(dǎo)的復(fù)雜性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明[3]。

氣道上皮細(xì)胞作為呼吸道的第一屏障，可視為哮喘病理改變的起點(diǎn)。過敏原和PM2.5等環(huán)境因子作用于氣道上皮，氣道上皮細(xì)胞在外界因子刺激下均可發(fā)生炎性病變，釋放多種炎性因子，包括白細(xì)胞介素（IL）-13（IL-13）、IL-33和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）等，大量的炎性因子累積加速了氣道上皮細(xì)胞凋亡，打破了氣道上皮屏障的完整性[4-5]。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為氣道上皮細(xì)胞損傷的刺激劑，可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥、自噬和凋亡等，進(jìn)而構(gòu)建多種體外細(xì)胞模型，模擬哮喘發(fā)病過程中的上皮損傷，揭示上皮損傷機(jī)制及藥物作用機(jī)制[6-7]。但LPS作用于氣道后，細(xì)胞因子的種類和水平如何變化，目前尚未有系統(tǒng)研究。此外，在文獻(xiàn)檢索過程中我們發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞模型評估相對匱乏，且誘導(dǎo)時間不固定。因此，綜合時間效應(yīng)和LPS刺激后的多種因子效應(yīng)，本課題進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為揭示上皮細(xì)胞受損后細(xì)胞因子水平的改變及哮喘機(jī)制研究提供更多的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人氣道上皮細(xì)胞（BEAS-2B，ACTT中國細(xì)胞資源庫）。

1.2 試藥與儀器

LPS（純度≥98%，貨號 551064，Sigma生物試劑公司）；IL-1β、IL-8、IL-6、TSLP、IL-13、IL-33、IL-17和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1） ELISA試劑盒（伊萊瑞特生物試劑有限公司）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（普利萊生物試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

將細(xì)胞以1×105個/孔接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后將孔板分為8組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，分為不同時間的空白組和LPS刺激組；吸棄24孔板培養(yǎng)上清液，空白組加入500 μL無血清培養(yǎng)基，LPS組加入500 μL LPS刺激劑（終質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1），于刺激后3、6、12和24 h分別收集細(xì)胞上清液。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作說明書，進(jìn)行樣品和標(biāo)準(zhǔn)品孵育、漂洗；生物化抗體孵育、漂洗；HRP酶孵育，漂洗和顯色處理，于450 nm處采用全波長酶標(biāo)儀檢測每個孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的濃度。采用硝酸還原酶法測定細(xì)胞上清中NO的水平，按照試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入樣品、標(biāo)準(zhǔn)品，而實(shí)驗(yàn)各孔加入Griess試劑，室溫避光孵育5 min，于540 nm處測定OD值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的濃度。

結(jié)果如圖1所示，與空白組比較，LPS刺激氣道上皮細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33和NO水平無顯著差異；且LPS作用氣道上皮細(xì)胞后3、6、12和24 h，細(xì)胞上清液中IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33和NO的分泌始終與空白組相似，均維持在較低的水平。與空白組比較，LPS作用氣道上皮細(xì)胞后3、6、12和24 h，氣道上皮細(xì)胞中炎癥因子IL-8、IL-6、IL-17和 MCP-1分泌均顯著增加（P＜0.01）；且LPS刺激6 h，氣道上皮細(xì)胞分泌的IL-8和MCP-1水平最高。此外，隨著LPS刺激時間的增加，氣道上皮細(xì)胞分泌的IL-6和IL-17水平也隨之增加，24 h的刺激時間下，IL-6和IL-17的分泌增加最明顯。

圖1 LPS對氣道上皮細(xì)胞IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33、NO、IL-8、IL-6、IL-17和 MCP-1分泌的影響Fig 1 Effect of LPS on secretion of IL-1β，TSLP，IL-13，IL-33，NO，IL-8，IL-6，IL-17 and MCP-1 by airway epithelial cells

3 討論

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，患者可發(fā)生間斷的小氣道阻塞，氣道上皮細(xì)胞是氣道炎癥反應(yīng)的起點(diǎn)，是肺部炎癥-免疫調(diào)節(jié)的第一道防線[8]。屋塵螨、PM2.5、卵清蛋白、花粉和真菌均能引起氣道的炎癥反應(yīng)，其中LPS作為一種內(nèi)毒素，常作為免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞炎性病變的誘導(dǎo)劑，可引起氣道上皮細(xì)胞損傷，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用LPS作用于人氣道上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LPS可促進(jìn)BEAS-2B細(xì)胞中IL-8、IL-6、IL-17和MCP-1分泌，且刺激時間3、6、24 h均能使其水平顯著增加；但對于IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33和NO水平無刺激作用。

在氣道上皮細(xì)胞中，LPS作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的一種成分，能夠誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，可通過激活細(xì)胞表面的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）等信號通路，促進(jìn)多種炎性因子的釋放[10-11]。IL-6和IL-8是常見的趨化因子，具有趨化中性粒細(xì)胞、級聯(lián)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的作用；在哮喘患者中，中性粒細(xì)胞型哮喘占比較大，由于產(chǎn)生過量的細(xì)胞外支架中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)，臨床較難醫(yī)治[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6哮喘小鼠BALF中炎癥介質(zhì)IL-6和IL-8分泌水平升高，且氣道上皮細(xì)胞可能通過旁分泌方式釋放IL-6和IL-8[13]。小白菊內(nèi)酯通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制氣道上皮細(xì)胞中IL-8的分泌[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可顯著刺激BEAS-2B細(xì)胞中IL-6和IL-8的分泌，但LPS刺激達(dá)峰時間不一致；因此，在哮喘機(jī)制的研究中，可以通過LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞損傷模型探究與IL-6和IL-8相關(guān)的發(fā)病機(jī)制。

MCP-1是趨化因子亞家族成員之一，其水平在哮喘患者外周血中升高，且與哮喘合并呼吸道感染相關(guān)[15-16]。孟魯司特聯(lián)合復(fù)可托或酮替芬可減輕急性發(fā)病期哮喘患者血清中MCP-1水平，進(jìn)而發(fā)揮抗哮喘作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS顯著增加了氣道上皮細(xì)胞MCP-1的分泌，且在刺激6 h后達(dá)峰，提示LPS刺激氣道上皮細(xì)胞損傷早期可釋放大量MCP-1類趨化因子，促進(jìn)血液中粒細(xì)胞及單核細(xì)胞向氣道內(nèi)轉(zhuǎn)移，加速氣道炎癥反應(yīng)。IL-17與中性粒細(xì)胞性哮喘緊密相關(guān)，可促進(jìn)杯狀細(xì)胞增殖、分泌黏液和氣道平滑肌增生，于多個環(huán)節(jié)加速哮喘病變[19]。以往IL-17與哮喘的關(guān)系研究多集中在患者血清水平、大鼠血清水平、中性粒細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞水平，鮮少涉及氣道上皮細(xì)胞，本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激氣道上皮細(xì)胞后，IL-17的水平不斷增加，在哮喘發(fā)病進(jìn)程中，氣道上皮細(xì)胞也是IL-17分泌的重要途徑。

IL-13主要由Th2型細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化、B細(xì)胞增殖及合成IgE類抗體，從而促進(jìn)炎癥-免疫應(yīng)答[20]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激BEAS-2B細(xì)胞3、6和24 h，細(xì)胞上清液中IL-13的分泌維持在較低的水平，無顯著性改變，該結(jié)果提示BEAS-2B細(xì)胞鮮少分泌IL-13，但研究發(fā)現(xiàn)IL-13可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞凋亡和黏液高分泌[21-22]。TSLP通過激活樹突狀細(xì)胞功能加快抗原傳遞，進(jìn)而破壞Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的分化平衡，調(diào)節(jié)因子IL-5和IL-10的水平。研究發(fā)現(xiàn)哮喘氣道炎癥的嚴(yán)重程度與TSLP的表達(dá)水平成正相關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS不能刺激BEAS-2B分泌大量的TSLP。高水平NO為氣道炎癥生物標(biāo)志物，對于老年哮喘患者有輔助診斷價(jià)值[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞炎癥損傷并不能使NO水平升高，針對呼出氣NO較高的哮喘患者，在藥物篩選和發(fā)病機(jī)制研究時，LPS刺激的BEAS-2B損傷模型可能不能作為細(xì)胞研究模型。

IL-1β和IL-33同屬IL-1亞族，均屬于促炎性細(xì)胞因子[25]；IL-1β主要在炎性損傷中由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，少部分可通過上皮細(xì)胞分泌[26]；IL-33是一種“雙功能細(xì)胞因子”，主要由屏障組織的上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞分泌，可有效驅(qū)動Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13，刺激巨噬細(xì)胞的M2極化，加速粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞募集，誘發(fā)過敏性哮喘[27]。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者和哮喘小鼠血清中IL-33和IL-1β水平顯著升高[28]，但本研究發(fā)現(xiàn)LPS作用于氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B不同的時間均不能引起細(xì)胞上清液中IL-33和IL-1β水平增加，該研究結(jié)果說明針對LPS刺激的氣道上皮細(xì)胞損傷模型可能不適用于IL-33和IL-1β分泌相關(guān)的哮喘機(jī)制研究。綜上所述，LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞損傷模型，適用于IL-8、IL-6、IL-17和MCP-1分泌相關(guān)的調(diào)控機(jī)制研究，但對于IL-1β、TSLP、IL-13、IL-33和NO調(diào)節(jié)的反應(yīng)性較差。