陳璀璀 李永磊 蘆二永

鼻咽癌為頭頸部惡性腫瘤,好發(fā)于我國南方地區(qū),與其他頭頸部惡性腫瘤相比,鼻咽癌在臨床表現(xiàn)、病因、腫瘤治療等方面均存在顯著差異,且易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移,疾病預(yù)后較差[1-3]。相關(guān)研究顯示,鼻咽癌確診病例中60%以上已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移[4]。通過對鼻咽癌患者預(yù)后效果進行評估,實施針對性分流及療效監(jiān)測,有助于提升治療效果,節(jié)約醫(yī)療資源。微RNAs(MicroRNAs)分子屬于非編碼小RNA,其中的miR-9分子可參與糖尿病、胚胎神經(jīng)發(fā)育及胃癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等惡性腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[5-6]。miR-194基因序列位于染色體上脆弱位點---1q41上,這同人類基因組中大多數(shù)miRNA編碼基因相同,位于同癌癥相關(guān)的不穩(wěn)定脆性位點[7]。但miR-9、miR-194在鼻咽癌患者中相關(guān)研究比較少?；诖?本研究嘗試探究miR-9、miR-194在鼻咽癌患者中的表達水平,以及對預(yù)后的預(yù)測價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月至2022年10月我院鼻咽癌患者76例,隨訪3～36個月,根據(jù)預(yù)后情況分為死亡組(n=21例),存活組(n=55例)。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診者;首次確診為鼻咽癌;臨床資料完整詳細。排除標(biāo)準(zhǔn):入院前曾接受抗腫瘤治療;合并其他惡病質(zhì);合并嚴(yán)重感染;精神障礙性疾病;處于妊娠或哺乳期;免疫功能異常;無其他伴發(fā)疾病。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 采用Excel表格,詳細統(tǒng)計患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、病灶部位、臨床分期、腫瘤分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移情況等。

1.2.2 miR-9、miR-194檢測方法 患者入院后取病理學(xué)組織,檢測癌組織中miR-9、miR-194表達,同時采取患者空腹外周靜脈血5 ml,留置于含促凝劑采血管中,在4 ℃的環(huán)境中靜置30 min,采用低溫離心機進行分離處理,設(shè)置離心轉(zhuǎn)速為3500 r/min,半徑為8 cm,時間為15 min,留取上清液,置于-20 ℃環(huán)境下保存;測定血清中miR-9、miR-194表達水平,提取總RNA,純化后采用紫外分光光度計測定RNA濃度、純度,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,應(yīng)用PCR引物上實時定量PCR儀及miRNA莖環(huán)引物檢測,條件95 ℃預(yù)變性0 min、95 ℃變性15 s、60 ℃ 1 min,40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參,目的基因相對表達量以2-△△Ct表示。由病理科醫(yī)師對每張切片取5個400倍視野,以染色強度結(jié)合陽性細胞百分比進行綜合積分,積分標(biāo)準(zhǔn):陰性(-)記0分,弱陽性(+)記1～4分,中度陽性(++)記5～8分,強陽性(+++)記9～12分,總分0～4分為低表達,5～12為高表達。

1.2.3 調(diào)強放療方法 所有鼻咽癌患者均接受調(diào)強放療,指導(dǎo)患者取仰臥體位,借助CT模擬機確定掃描中心,以層厚3 mm進行CT掃描,圖像重建,明確高危及低危臨床靶向體積,兩者用藥均為2.0 Gy/f,總量維持在55 Gy,28次/6周作為首個療程,隨后根據(jù)個體情況適當(dāng)放緩放療頻率,每3個月復(fù)查一次。

1.2.4 隨訪方法及預(yù)后情況 治療后均持續(xù)隨訪3～36個月,以門診登記訪問或電話隨訪為主,了解患者預(yù)后情況,死亡患者以死亡時間為隨訪截止時間,無患者失聯(lián)或中途退出。76例鼻咽癌患者,21例死亡,55例存活。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)比較不同臨床特征的鼻咽癌患者miR-9、miR-194表達水平。(2)比較不同預(yù)后的鼻咽癌患者miR-9、miR-194表達水平。(3)分析鼻咽癌患者預(yù)后相關(guān)影響因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0處理數(shù)據(jù),計數(shù)資料以例數(shù)描述,采用χ2檢驗,計量資料采取Bartlett方差齊性檢驗與Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗,均確認(rèn)具備方差齊性且近似服從正態(tài)布,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;采用Logistic多因素回歸分析鼻咽癌患者預(yù)后的影響因素。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征鼻咽癌患者miR-9表達水平比較

76例鼻咽癌患者miR-9高表達29例,低表達47例,miR-9表達水平與鼻咽癌患者年齡、性別、BMI、病灶部位無關(guān)(P>0.05);miR-9低表達患者的臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤分期為T3～T4期、組織分化程度為高、中分化、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的比例高于miR-9高表達患者(P<0.05),見表1。

表1 不同臨床特征鼻咽癌患者miR-9表達水平(例,%)

2.2 不同臨床特征的鼻咽癌患者miR-194表達水平比較

76例鼻咽癌患者,miR-194高表達35例,低表達41例,miR-194表達水平與鼻咽癌患者年齡、性別、BMI、病灶部位無關(guān)(P>0.05);miR-194低表達患者的臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤分期為T3～T4期、組織分化程度為高、中分化、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的比例高于miR-194高表達患者(P<0.05),見表2。

表2 不同臨床特征鼻咽癌患者miR-194表達水平(例,%)

2.3 不同預(yù)后的鼻咽癌患者臨床資料比較

兩組患者年齡、性別、BMI、病灶部位相比無顯著差異(P>0.05),兩組臨床分期、腫瘤分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移情況、miR-9表達水平、miR-194表達水平比較差異顯著(P<0.05),見表3。

表3 不同預(yù)后的鼻咽癌患者臨床資料比較(例,%)

2.4 鼻咽癌患者預(yù)后相關(guān)影響因素

經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示,臨床分期、腫瘤分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移情況、miR-9表達水平、miR-194表達水平為鼻咽癌患者預(yù)后影響因素(P<0.05),見表4。

表4 鼻咽癌患者預(yù)后Logistic回歸分析

3 討論

鼻咽癌是發(fā)源于鼻咽腔側(cè)壁及頂部的惡性腫瘤,中國為鼻咽癌高發(fā)國家,且發(fā)病率呈逐漸升高趨勢,已成為我國重點關(guān)注的健康問題[8-10]。既往研究顯示,鼻咽癌患者一旦發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移,其中位生存期往往不超過1年[11]。因此,如何有效預(yù)測及進一步改善鼻咽癌疾病預(yù)后尤為重要。

近年來,miRNAs生物學(xué)作用備受臨床關(guān)注,有研究認(rèn)為其可通過調(diào)控相應(yīng)靶基因進而參與細胞中各種生命活動[12-13]。相關(guān)文獻報道[14]在腫瘤細胞中,多數(shù)受miRNAs調(diào)控的基因在癌癥發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,故推測miRNAs在腫瘤治療方面具有一定應(yīng)用價值。此外,miRNAs在腫瘤樣品中表達量發(fā)生變化,被證實具有診斷或預(yù)后價值。比如,特定濃度的miR-149-5p可促進胃癌細胞增殖與遷移,有望成為胃癌預(yù)防新靶標(biāo)[15]。王皓穎等[16]研究發(fā)現(xiàn),miR-93表達水平對鼻咽癌預(yù)后效果評估價值良好。除上述miRNAs成員外,在鼻咽癌患者臨床同樣發(fā)現(xiàn)一些具有較高臨床意義的miRNAs標(biāo)志物,如miR-9、miR-194等,但目前臨床對其在鼻咽癌中的作用認(rèn)識仍較為有限?；诖?本研究對miR-9、miR-194在鼻咽癌中表達情況進行系統(tǒng)調(diào)查,以了解miR-9、miR-194與鼻咽癌發(fā)生的關(guān)系及預(yù)后相關(guān)性,旨在為臨床治療鼻咽癌及改善預(yù)后提供新的研究思路。由本研究數(shù)據(jù)可知,76例鼻咽癌患者miR-9高表達29例,低表達47例,miR-194高表達35例,低表達41例,說明miR-9、miR-194可能是潛在的鼻咽癌抑癌基因,進一步進行統(tǒng)計學(xué)分析驗證,發(fā)現(xiàn)miR-9、miR-194低表達患者的臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤分期為T3～T4期、組織分化程度為高度/中等分化、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的比例高于miR-9、miR-194高表達患者,一定程度上說明miR-9、miR-194可能參與鼻咽癌腫瘤發(fā)展過程中。有研究認(rèn)為[17],E-cadherin變化為miR-9調(diào)節(jié)鼻咽癌腫瘤細胞遷移及侵襲能力的關(guān)鍵蛋白,負(fù)向調(diào)控鼻咽癌細胞中miR-9表達,可抑制腫瘤細胞侵襲、增殖及遷移。既往研究表明[18],miR-194-5p低表達可激活mTOR信號通路,對細胞增殖及侵襲具有上調(diào)作用,miR-194-5p過表達可抑制mTOR信號通路,對細胞增殖及侵襲具有下調(diào)作用。上述研究為本研究結(jié)果提供佐證。

miRNAs在鼻咽癌相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)、蛋白表達調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用,同腫瘤細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能是評估鼻咽癌預(yù)后的新靶點[19]。本研究隨訪3～36個月,發(fā)現(xiàn)76例鼻咽癌患者,21例死亡,55例存活,比較不同預(yù)后的鼻咽癌患者臨床資料發(fā)現(xiàn),兩組臨床分期、腫瘤分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移情況、miR-9表達水平、miR-194表達水平比較差異顯著(P<0.05),說明鼻咽癌患者臨床特征及miR-9、miR-194表達水平與預(yù)后結(jié)果相關(guān)。Lu等[20]研究證實,鼻咽癌細胞分泌的miR-9主要以外泌體介導(dǎo)形式進入內(nèi)皮細胞發(fā)揮功能,對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生影響,參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移等。已有研究報道m(xù)TOR通路在頭頸部鱗癌的作用機制,有研究認(rèn)為,miR-194-5p表達下調(diào),可促進磷酸化狀態(tài)的mTOR表達,上調(diào)繼續(xù)與下游底物結(jié)合的能力,進而發(fā)揮促癌作用[21]。進行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),臨床分期、腫瘤分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移情況、miR-9表達水平、miR-194表達水平為鼻咽癌患者預(yù)后影響因素(P<0.05),進一步證明miR-9、miR-194表達水平與鼻咽癌患者預(yù)后息息相關(guān),綜合考慮miR-9、miR-194表達,不但能反映鼻咽癌惡性生物學(xué)行為進程,還可提高對預(yù)后不良結(jié)局的預(yù)測效果。

綜上所述,miR-9、miR-194低表達與鼻咽癌患者惡性生物學(xué)行為進程及預(yù)后有關(guān),該研究提示miR-9、miR-194可能是鼻咽癌預(yù)后評估的有效分子靶點,值得臨床進一步深入探究。