陳媛琳 羅 婷 彭子萍

卵巢癌是女性生殖道比較致命的惡性腫瘤,可發(fā)生在任何年齡段[1]。卵巢癌的發(fā)病比較隱匿,早期無(wú)明顯的體征和癥狀,一經(jīng)確診就被診斷為癌癥晚期,其中有65%以上的患者確診時(shí)已為Ⅲ期或Ⅳ期,癌灶已經(jīng)在腹腔內(nèi)彌散轉(zhuǎn)移,而且晚期卵巢癌患者的5年生存率只為20%[2],預(yù)后較差,是威脅女性健康的主要腫瘤。TRAF4屬于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAFs)家族的一員,是一類重要的胞漿銜接蛋白[3]。TRAF4早期在乳腺癌的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中被發(fā)現(xiàn),后發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中高表達(dá),能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,在腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。Eg5 是驅(qū)蛋白家族 kinesin-5之一,相關(guān)研究表明,Eg5也在多種腫瘤組織中高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后關(guān)系密切[5]。目前,尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于TRAF4和Eg5在卵巢癌中的相關(guān)報(bào)道,因此本研究探討TRAF4和Eg5在卵巢癌中的表達(dá)以及與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性,為卵巢癌的早期診斷和預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2017年5月至2020年6月本院收治的行手術(shù)治療的卵巢癌患者術(shù)后石蠟包埋組織標(biāo)本65例。納入標(biāo)準(zhǔn):有完整的臨床資料;均經(jīng)過(guò)病理學(xué)診斷為卵巢癌患者;術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療、免疫治療等;均為原發(fā)性腫瘤,并為首次手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):合并心腦血管疾病以及其他惡性腫瘤的患者;卵巢癌轉(zhuǎn)移的患者;合并急慢性疾病感染和免疫性疾病的患者;存在認(rèn)知障礙和精神疾病的患者。并選取同期入本院接受手術(shù)治療的卵巢上皮性良性病變腫瘤組織36例和因子宮肌瘤行全子宮及附件切除術(shù)的正常卵巢組織36例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 將石蠟標(biāo)本切成厚度為4 μm的切片,烤片、脫蠟、水化和檸檬酸抗原修復(fù),并加入100 μl的H2O2液,靜止15 min后,采用PBS沖洗后,滴加50 μl的TRAF4和Eg5抗體(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司),恒溫放置24 h,取出切片,PBS沖洗,二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液溫孵育30 min,PBS沖洗,二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木精復(fù)染,脫水、透明及封片,放置在鏡下觀察。每張切片由2名病理學(xué)家進(jìn)行獨(dú)立評(píng)估對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分,陽(yáng)性細(xì)胞占比:0%為0分,1%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分;染色強(qiáng)度:無(wú)著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分,陽(yáng)性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度相乘分?jǐn)?shù)≥ 4分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 將石蠟標(biāo)本烤片、脫蠟,加入1 ml Trizol提取總RNA,用紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京邁克沃德生物科技有限公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),TRAF4正向引物序列為5'-TTCACTCT GCTATCTTCATCTGC-3'; 反向引物序列為5'-ATATCGCGCCGCTGTCGCTGCT-3';Eg5正向引物序列為5'-AAATCTTGCCTCCGAGGTG-3'; 反向引物序列為5'-TGGTGCG GTAGATGTCG-3'; PCR總反應(yīng)體系為20 μl,PCR反應(yīng)條件:95 ℃,15 min,起始模板變性,95 ℃,10 s,PCR循環(huán)模板變性,58 ℃,30 s,退火,72 ℃,30 s,延伸,40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法計(jì)算TRAF4和Eg5 mRNA相應(yīng)的數(shù)值。TRAF4以1.36為截?cái)嘀颠M(jìn)行分組,>1.365為TRAF4高表達(dá)組(n=34),≤1.36為TRAF4低表達(dá)組(n=31);Eg5以1.48為截?cái)嘀颠M(jìn)行分組,>1.48為Eg5高表達(dá)組(n=35),≤1.48為Eg5低表達(dá)組(n=30)。

1.2.3 隨訪 以電話或者門診的形式進(jìn)行隨訪,隨訪的截至日期為2022年7月,計(jì)算術(shù)后5年總生存率和生存時(shí)間,并進(jìn)行記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TRAF4和Eg5在卵巢癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)

卵巢癌組織中TRAF4和Eg5的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于良性病變組織和正常卵巢組織(P<0.001),良性病變組織中TRAF4和Eg5的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織(P<0.001),見(jiàn)表1。

表1 卵巢癌、良性腫瘤及正常卵巢組織中TRAF4和Eg5的表達(dá)比較(例,%)

2.2 TRAF4和Eg5 mRNA在各組織中的表達(dá)

卵巢癌組織中TRAF4和Eg5 mRNA表達(dá)率明顯高于良性病變組織和正常卵巢組織(P<0.001),良性病變組織中TRAF4和Eg5mRNA表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織(P<0.001),見(jiàn)表2。

表2 卵巢癌、良性腫瘤及正常卵巢組織中TRAF4和Eg5mRNA的表達(dá)比較

2.3 TRAF4和Eg5 mRNA水平與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性

不同年齡、組織學(xué)類型、腫瘤大小、分化程度的TRAF4和Eg5 mRNA水平對(duì)比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TRAF4和Eg5 mRNA水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.001),FIGO 分期中Ⅲ～Ⅳ期的TRAF4和Eg5 mRNA水平明顯高于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.001),浸潤(rùn)程度T3～T4期TRAF4和Eg5 mRNA水平顯著高于T1～T2期(P<0.001),見(jiàn)表3。

表3 TRAF4和Eg5 mRNA水平與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 TRAF4與Eg5表達(dá)的相關(guān)性

Person相關(guān)性分析結(jié)果顯示,TRAF4與Eg5表達(dá)水平呈正相關(guān)性(γ=0.326,P<0.001)。

2.5 TRAF4和Eg5對(duì)卵巢癌早期診斷效能

繪制TRAF4和Eg5檢測(cè)的ROC曲線用于卵巢癌的早期診斷,結(jié)果顯示,TRAF4的ROC曲線面積為0.837(95%CI:0.765～0.908,P<0.001),截?cái)嘀禐?.36時(shí),靈敏度為73.85%,特異度為81.54%;Eg5的ROC曲線面積為0.913(95%CI:0.864～0.961,P<0.001),截?cái)嘀禐?.48時(shí),靈敏度為87.69%,特異度為81.54%,見(jiàn)圖1。

2.6 TRAF4和Eg5 mRNA對(duì)卵巢癌預(yù)后的影響

本組病例共隨訪25～60個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為49個(gè)月,總生存率為56.92%。Kaplan-Meier曲線分析顯示,TRAF4高表達(dá)組患者5年總生存率為47.06%,明顯低于TRAF4低表達(dá)組患者(67.74%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Eg5高表達(dá)組患者5年總生存率為42.86%,明顯低于Eg5低表達(dá)組患者(73.33%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 不同TRAF4和Eg5 mRNA水平卵巢癌患者的生存曲線

3 討論

卵巢癌發(fā)病率約占女性全身惡性腫瘤的4%,發(fā)病率列居第三位,僅次于宮頸癌和宮體癌[6]。另外該病的死亡率也比較高,據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)報(bào)道,卵巢癌占全球女性死亡數(shù)的4.7%,對(duì)女性的生命造成了嚴(yán)重的威脅[7]。由于卵巢癌解剖位置處于盆腔的深部,與其他的婦科惡性腫瘤相比,卵巢癌早期癥狀難以發(fā)現(xiàn),而且惡性程度較高,進(jìn)展快,一經(jīng)診斷大部分患者已經(jīng)為臨床晚期,已擴(kuò)散到子宮雙側(cè)附件,大網(wǎng)膜及盆腔各器官,經(jīng)過(guò)治療后復(fù)發(fā)率較高。因此,尋找新的潛在有效的靶向基因及生物標(biāo)志物是卵巢癌診斷和治療的關(guān)鍵。

TRAF蛋白屬于細(xì)胞質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白家族中的一種,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮主要作用[8]。在免疫系統(tǒng)中,TRAF蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NF-kB或者AP-1等信號(hào)通路,并激活部分轉(zhuǎn)錄因子[9]。另外,TRAF4也表達(dá)于乳腺癌及轉(zhuǎn)移病灶的上皮細(xì)胞,參與多種信號(hào)通路調(diào)控和參與細(xì)胞的增殖、侵襲和乳腺癌的轉(zhuǎn)移[10]。TRAF4定位于細(xì)胞核,可能是一種轉(zhuǎn)錄因子。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),TRAF4在肺炎癥反應(yīng)和前列腺癌等癌組織中異常表達(dá)[11]。但在卵巢癌中的相關(guān)報(bào)道較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),卵巢癌組織中TRAF4陽(yáng)性表達(dá)率和TRAF4 mRNA明顯高于良性病變組織和正常卵巢組織,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中TRAF4 mRNA水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織,FIGO 分期中Ⅲ～Ⅳ期中TRAF4 mRNA水平明顯高于Ⅲ～Ⅳ期,浸潤(rùn)度T3-T4期中TRAF4 mRNA水平顯著高于T1-T2期;且對(duì)卵巢癌的診斷價(jià)值較高,TRAF4高表達(dá)組患者的5 年總生存率明顯低于TRAF4低表達(dá)組。相關(guān)研究表明,TRAF4的基因擴(kuò)增是TRAF4蛋白在人類腫瘤中高表達(dá)的因素之一[12]。從而推斷TRAF4可能在癌癥中的診斷和預(yù)后都具有至關(guān)重要的作用。

Eg5是一種有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白,屬驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員之一[13]。Eg5基因定位于10q24,E95基因的缺失、突變或者Eg5蛋白的過(guò)表達(dá)和多種癌癥的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)和預(yù)后具有一定的相關(guān)性[14]。近年來(lái)大量的研究發(fā)現(xiàn),Eg5 mRNA的高表達(dá)存在于肺癌、直腸癌、乳腺癌和宮頸癌中,這可能與Eg5促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖相關(guān)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),卵巢癌組織中Eg5陽(yáng)性表達(dá)率和 Eg5 mRNA明顯高于良性病變組織和正常卵巢組織,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中Eg5 mRNA水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織,FIGO 分期中Ⅲ～Ⅳ期中Eg5 mRNA水平明顯高于Ⅲ～Ⅳ期,浸潤(rùn)度T3-T4期中Eg5 mRNA水平顯著高于T1-T2期;且對(duì)卵巢癌的診斷價(jià)值較高,Eg5高表達(dá)組患者的5 年總生存率明顯低于Eg5低表達(dá)組,說(shuō)明Eg5也在卵巢癌的診斷和預(yù)后中也起著至關(guān)重要的作用。相關(guān)研究表明,Eg5蛋白在肺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá);Eg5蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),Eg5陽(yáng)性提示肺癌患者預(yù)后不良。也有研究表明,Eg5在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá),高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床分期及轉(zhuǎn)移有關(guān),Eg5可預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,與本研究結(jié)果類似。相關(guān)研究通過(guò)質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRAF4可能存在相互作用的待選蛋白,其中包括有絲分裂相關(guān)蛋白Eg5[16]。TRAF4在細(xì)胞有絲分裂期的表達(dá)量高于分裂間期,且在有絲分裂前、中、后、末期均與 Eg5 共定位,干擾 TRAF4的表達(dá),Eg5 蛋白的表達(dá)量會(huì)降低[17]。本研究進(jìn)一步通過(guò)Person相關(guān)性分析驗(yàn)證了TRAF4和Eg5的相關(guān)性,結(jié)果表明,TRAF4和Eg5水平呈正相關(guān)。但有關(guān)TRAF4和Eg5相互作用以及在卵巢癌中的相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,TRAF4和Eg5在卵巢癌中高表達(dá),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期和浸潤(rùn)程度相關(guān),檢測(cè)TRAF4和Eg5的表達(dá)對(duì)于卵巢癌的早期診斷和預(yù)后具有一定的診斷價(jià)值,有望成為卵巢癌新型藥物治療的靶點(diǎn)。本研究存在一定的不足,關(guān)于TRAF4和Eg5相互作用機(jī)制未在本研究中進(jìn)行報(bào)道,所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)驗(yàn)證TRAF4和Eg5相互作用以及在卵巢癌發(fā)展中的相關(guān)機(jī)制。